申晨晨 熊昊杰 馬 艷

砷是存在于地殼中的有毒類金屬元素，廣泛分布于自然界中，是一種環(huán)境毒物和致癌物。長期砷暴露會導(dǎo)致皮膚、肝臟、膀胱、腎臟和肺部癌癥以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)組織的病變。大量文獻(xiàn)已證實(shí)無機(jī)砷是一種神經(jīng)毒物，可導(dǎo)致人或動物行為改變，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化、凋亡和壞死等。神經(jīng)細(xì)胞不易再生且對有毒物質(zhì)十分敏感，因此砷對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性研究尤為重要。神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)，砷作為一種神經(jīng)毒物會如何影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移與凋亡目前還不清楚。本研究通過觀察NaAsO對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞)增殖、遷移、凋亡及活性氧生成水平的影響，探討砷導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞損傷的可能作用機(jī)制。

材料與方法

1.細(xì)胞株：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NE-4C細(xì)胞)購自廣州吉妮歐公司。

2.試劑與儀器：胎牛血清(FBS)、MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液、PBS緩沖液和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；谷氨酰胺購自以色列BI公司；亞砷酸鈉(NaAsO，分析純)購自北京化學(xué)試劑三廠；CCK-8試劑、Hoechst 33342染色試劑、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、結(jié)晶紫、GAPDH購自北京索萊寶公司；caspase-12購自英國Abcam公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、anti-rabbit IgG-HRP購自美國CST公司。高速離心機(jī)購自美國Sigma公司；熒光倒置顯微鏡購自中國麥克迪奧公司；超凈工作臺、酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：NE-4C細(xì)胞于高糖MEM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺)，37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期NE-4C細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)，分為對照組及NaAsO處理組，其中NaAsO處理組分別用0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L NaAsO處理，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取合適密度進(jìn)行鋪板，細(xì)胞貼壁后NaAsO干預(yù)，活性氧指標(biāo)干預(yù)6h，其余實(shí)驗(yàn)干預(yù)24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖指標(biāo)：取干預(yù)后96孔板細(xì)胞，每孔加入10μl CCK-8試劑于培養(yǎng)箱中孵育2h，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測各孔的值。抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組值-空白組值)/(對照組值-空白組值)×100%。

5.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力：取干預(yù)后Transwell小室，4%多聚甲醛固定20min，1%結(jié)晶紫染色20min，PBS漂洗后棉簽去除小室內(nèi)細(xì)胞，倒置顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。

6.Hoechst 33342熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡：取干預(yù)后6孔板細(xì)胞，每孔加入1ml的Hoechst 33342稀釋液(10μg/ml)染色20min，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變；出現(xiàn)細(xì)胞核體積縮小、固縮、染色質(zhì)濃縮或凋亡小體形成則判斷為凋亡細(xì)胞。

7.DCFH-DA活性氧熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平：取干預(yù)后NE-4C細(xì)胞，按照說明書進(jìn)行熒光探針的裝載以及細(xì)胞核染色，共聚焦顯微鏡下拍照，圖片采用Image J處理，以熒光強(qiáng)度代表活性氧含量。

8.Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平：取干預(yù)后細(xì)胞，裂解液冰上裂解30min，取上清蛋白定量及變性，根據(jù)蛋白相對分子質(zhì)量配置凝膠，樣品按照等體積等濃度上樣，電泳、電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h，洗膜后ECL發(fā)光試劑顯影，采用Image J對條帶灰度值進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.NaAsO對NE-4C細(xì)胞增殖的影響：CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaAsO對NE-4C細(xì)胞的抑制率隨藥物濃度的增加逐漸增加，經(jīng)過GraphPad分析，NaAsO對NE-4C細(xì)胞的 IC為1.786μmol/L，因此NaAsO處理組定為0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L。NaAsO干預(yù)24h后，細(xì)胞抑制率隨NaAsO濃度升高而升高(=321.6，<0.05，圖1)。

2.NaAsO對NE-4C細(xì)胞遷移的影響：Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了NE-4C細(xì)胞在NaAsO作用下遷移能力的變化。如圖所示，NaAsO處理后，NE-4C細(xì)胞的遷移能力呈下降趨勢，表現(xiàn)為穿過Transwell小室的細(xì)胞隨著NaAsO濃度的升高數(shù)量逐漸減少，2.4及3.2μmol/L NaAsO處理組幾乎沒有細(xì)胞穿過小室(=128.2，<0.05，圖2)。

3.NaAsO對NE-4C細(xì)胞凋亡的影響：倒置熒光顯微鏡下觀察到Hoechst 33342染色后，對照組的NE-4C細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核輪廓清晰，呈弱藍(lán)色熒光，染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象不明顯；處理組細(xì)胞核呈亮藍(lán)色熒光，且隨著NaAsO濃度增加，各組的亮藍(lán)色熒光逐漸增多，染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象加重，其中3.2μmol/L組由于細(xì)胞貼壁能力下降，細(xì)胞的數(shù)量減少，但染色質(zhì)濃縮最嚴(yán)重，熒光強(qiáng)度最為明顯，詳見圖3。

4.NaAsO對細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響：用平均熒光強(qiáng)度表示各組細(xì)胞的ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.4、0.8μmol/L組細(xì)胞ROS水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，之后隨NaAsO濃度的升高細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度逐漸升高(=57.557，<0.05，圖4)。

5.NaAsO對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響：Western blot法檢測NaAsO對NE-4C細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，0.4、0.8、1.6μmol/L組GRP78蛋白表達(dá)未見明顯變化，2.4及3.2μmol/L組表達(dá)水平升高(=12.484，<0.05，圖5B)；caspase-12蛋白表達(dá)水平從1.6μmol/L組開始逐漸升高(=26.283，<0.05，圖5C)；CHOP蛋白表達(dá)水平隨干預(yù)濃度升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=18.969，<0.05，圖5D)。

討 論

越來越多的動物和人群研究證據(jù)表明，砷暴露與神經(jīng)發(fā)育毒性、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥和認(rèn)知發(fā)展、學(xué)習(xí)和記憶損害等方面有關(guān)。砷可以通過血-腦脊液屏障，在大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)和基底核等結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的神經(jīng)毒性；砷也可通過胎盤屏障，直接影響胚胎期大腦的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育會被砷影響，可引起神經(jīng)元細(xì)胞、星膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞死亡，但砷對神經(jīng)干細(xì)胞的毒性損傷作用研究較少，本研究從細(xì)胞水平探討NaAsO對神經(jīng)發(fā)育損傷的影響。CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)與其他神經(jīng)細(xì)胞比較，NE-4C細(xì)胞對NaAsO的毒性作用更敏感，NaAsO對SH-SY5Y細(xì)胞的IC為50μmol/L，對PC12細(xì)胞活力造成損傷的最低濃度為40μmol/L，而NaAsO對NE-4C細(xì)胞的 IC為1.786μmol/L。較低濃度的NaAsO就會對細(xì)胞造成毒性損傷，影響細(xì)胞的增殖和遷移能力，使凋亡細(xì)胞增多。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使可調(diào)節(jié)許多信號分子，細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、衰老等過程的信號通路都可被其影響。正常情況下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除是動態(tài)平衡的，當(dāng)ROS產(chǎn)出大于清除時細(xì)胞發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激，Ca平衡失調(diào)和氧化應(yīng)激是誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)的重要因素。Wang等研究發(fā)現(xiàn),砷干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯上升，而加入抗氧化劑則可降低ROS水平，使細(xì)胞凋亡率下降。ROS可引發(fā)ERS，持續(xù)的ERS可激活相應(yīng)的凋亡因子引起細(xì)胞凋亡。本研究中，NaAsO干預(yù)細(xì)胞6h后即可檢測到ROS水平變化，說明ROS的產(chǎn)生是細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期事件。

引起細(xì)胞凋亡的3種途徑中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑較受關(guān)注。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是通過錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔中堆積來表達(dá)的，此外，蛋白質(zhì)合成過多、鈣蓄積、氧化應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏和感染等都會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。輕度ERS對細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，持續(xù)的ERS可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。GRP78廣泛分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是ERS的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平能夠反映出ERS的發(fā)生、發(fā)展。

CHOP是介導(dǎo)ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下低表達(dá)，當(dāng)ERS時很多信號通路都可誘導(dǎo)CHOP使其表達(dá)量增加，參與到下游細(xì)胞凋亡途徑。caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的凋亡效應(yīng)蛋白，當(dāng)其被激活時可進(jìn)一步激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Lu等研究發(fā)現(xiàn)，AsO可導(dǎo)致腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(neuro-2a)發(fā)生凋亡，使ERS相關(guān)分子(GRP78、XBP-1和CHOP) 蛋白以及基因水平的表達(dá)上調(diào)；有研究發(fā)現(xiàn),NaAsO作用于SH-SY5Y細(xì)胞時可使細(xì)胞GRP78、CHOP等蛋白的表達(dá)水平上調(diào)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，NaAsO可使NE-4C細(xì)胞內(nèi)GRP78、caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)水平上調(diào)，意味著NaAsO可引起NE-4C細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)NE-4C細(xì)胞對NaAsO較為敏感，較低濃度就可抑制細(xì)胞增殖遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡可能是由于ROS水平增高引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。