辛 婧 沈亞非 王朝旭 謝亞爭(zhēng)

S100A16是鈣調(diào)蛋白S100家族的新成員，S100蛋白與細(xì)胞增殖、分化、凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，S100A16在正常食道、脂肪、肺、甲狀腺、胰腺、結(jié)腸等組織中高表達(dá)，且在不同的組織中參與了不同的細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡作用，有可能存在比S100家族其他成員更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制[1,2]。S100A16是筆者課題組在前期對(duì)肥胖相關(guān)基因研究中通過基因芯片篩查到的差異表達(dá)基因，并證實(shí)S100A16促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)合成從而促使肥胖發(fā)生[3,4]。脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞均來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，兩者存在此消彼長的關(guān)系，即S100A16促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的同時(shí)可能抑制成骨細(xì)胞生成[5]。目前，S100A16與成骨分化的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)S100A16與成骨分化進(jìn)行生物信息學(xué)相關(guān)性分析，并通過構(gòu)建S100A16慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化，觀察S100A16對(duì)成骨分化的影響，初步探討S100A16基因在成骨分化中的作用，為進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)庫及分析數(shù)據(jù)：采用來自美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)和可視化平臺(tái)GEO2R對(duì)S100A16與成骨分化進(jìn)行生物信息學(xué)相關(guān)性分析。

2.材料：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；地塞米松、茜素紅、FBS緩沖液、β-甘油磷酸鈉購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa公司；PLKO.1-sP6-GFP空病毒載體由南京醫(yī)科大學(xué)分子遺傳研究室李建民教授饋贈(zèng)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Pierce BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；S100A16、CD14、CD34、CD45、CD44、CD90、CD105兔源一抗、PE偶聯(lián)羊抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；IgG-辣根過氧化物酶羊抗兔二抗、β-actin抗體購自美國CST公司。

3.生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理：根據(jù)GEO數(shù)據(jù)集中不同收錄信息，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)S100A16在正常C57BL6小鼠各主要組織器官中的表達(dá)情況(GEO測(cè)序數(shù)據(jù)登錄號(hào)：GDS3142)；檢測(cè)4組正常MC3TC-E1成骨前體細(xì)胞(control)、3組曲古抑菌素 A誘導(dǎo)成骨分化的成骨前體細(xì)胞(TSA treated)中S100A16的表達(dá)情況(GEO測(cè)序數(shù)據(jù)登錄號(hào)：GSE92470)。在GEO2R分析頁面輸入GEO測(cè)序數(shù)據(jù)登錄號(hào)，確定樣本分組后，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行S100A16的表達(dá)量分析，導(dǎo)出生成的柱狀圖。

4.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和操作順序經(jīng)漯河市中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(審批號(hào)：2020018)，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理?xiàng)l例，并按照國家衛(wèi)生研究院“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南”的規(guī)定執(zhí)行。頸椎脫臼處死大鼠后用75%乙醇溶液浸泡15min，無菌操作分離股骨與脛骨，用DMEM培養(yǎng)液吸取大鼠骨髓輕吹打使溶液混勻，選用22號(hào)注射針頭濾制溶液制備成單細(xì)胞懸液，接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),每2～3天換液。傳至第3代流式細(xì)胞儀鑒定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。

5.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定：選取第3代生長狀態(tài)良好的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，胰酶消化3min，收集細(xì)胞懸液于1000r/min室溫離心5min，棄上清后用無菌PBS重懸細(xì)胞并過200目篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液。各管樣本分別加入CD44、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45的單克隆抗體，同時(shí)設(shè)立同型陰性對(duì)照，4℃避光孵育，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

6.慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)成骨分化:筆者課題組早期構(gòu)建了過表達(dá)S100A16慢病毒載體(PLJM1-S100A16-GFP)，轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs并篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞株，建立S100A16過表達(dá)組、空載對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染載體的正常BMSCs組。分別加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液(含10%PBS的DMEM培養(yǎng)基+10mmol/L β甘油磷酸鈉+0.05mmol/L維生素C+100mmol/L地塞米松)，每3天換液1次，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)21天，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

7.Western blot法檢測(cè)：分別抽提第3代正常BMSCs組、轉(zhuǎn)入慢病毒載體PLJM1-S100A16-GFP的S100A16過表達(dá)組及轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒PLJM1的空載對(duì)照組的總蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，100V穩(wěn)壓電泳，半干轉(zhuǎn)膜。一抗為濃度1∶500的S100A16多克隆抗體，二抗為1∶2000的羊抗兔IgG一辣根過氧化物酶，用免疫印跡化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。以 GAPDH 作為內(nèi)參，應(yīng)用 Image J軟件分析各組蛋白條帶灰度比值的變化。

8.RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平：取S100A16過表達(dá)組、空載對(duì)照組、正常BMSCs組的第3代BMSCs細(xì)胞，誘導(dǎo)成骨分化，培養(yǎng)14天提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)因子堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄核心因子 2(Runx2)的表達(dá)，GAPDH 設(shè)為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt表示，繪制柱狀圖。相關(guān)引物序列詳見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

9.茜素紅染色檢測(cè)成骨分化能力：在BMSCs向成骨分化過程中，細(xì)胞表面沉積鈣鹽形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅與鈣發(fā)生顯色反應(yīng)，通過茜素紅染色鑒定鈣結(jié)節(jié)形成情況。BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化21天后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌 2～3 次，甲醛緩沖液固定15min，蒸餾水洗滌3次，加入0.1%茜素紅-Tris-HCL染液(pH值為8.3)，37℃下染色30min，蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察茜素紅染色陽性細(xì)胞。

結(jié) 果

1.S100A16在各組織中的表達(dá)情況生物信息學(xué)分析：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)S100A16在正常C57BL6小鼠各主要組織器官中的表達(dá)情況，分析發(fā)現(xiàn)S100A16基因在骨髓中的表達(dá)顯著低于其他組織(圖1)，提示其表達(dá)與成骨呈負(fù)相關(guān)。

圖1 S100A16在正常C57BL6小鼠各主要組織器官中的表達(dá)情況

2.S100A16在成骨細(xì)胞分化中的表達(dá)情況分析：已有文章表明曲古抑菌素 A可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[6，7]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Ρ日C3TC-E1成骨前體細(xì)胞(control)和曲古抑菌素 A誘導(dǎo)成骨分化的成骨前體細(xì)胞(TSA treated)中S100A16的表達(dá)情況，分析發(fā)現(xiàn)S100A16基因在經(jīng)TSA誘導(dǎo)成骨分化的細(xì)胞中表達(dá)量顯著降低(圖2)，提示S100A16表達(dá)量與成骨分化呈負(fù)相關(guān)。

圖2 S100A16在正常成骨前體細(xì)胞組和曲古抑菌素A誘導(dǎo)分化組中的表達(dá)情況

3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式鑒定：取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示CD44、CD90和CD105的陽性率分別為96.6%、96.9%和97.7%。而CD14、CD34和CD45呈陰性表達(dá)(圖3)，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。

圖3 流式鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面陽性標(biāo)志物(CD44、CD90和CD105)表達(dá)均在96%以上，陰性標(biāo)志物(CD44、CD34和CD45)表達(dá)均在2%以下，均符合要求

4.S100A16在各組細(xì)胞的表達(dá)情況：收集各組細(xì)胞蛋白，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，S100A16過表達(dá)組(PLJM1-S100A16-GFP-BMSCs)與空載對(duì)照組(PLJM1-BMSCs)及正常BMSCs組比較，S100A16蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05,圖4)，表明S100A16穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖4 S100A16蛋白表達(dá)情況A.S100A16蛋白表達(dá)的免疫印跡條帶；B.S100A16相對(duì)于GAPDH蛋白表達(dá)水平的灰度值；*P<0.05

5.各組細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況:實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，S100A16過表達(dá)組(PLJM1-S100A16-GFP-BMSCs)細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子ALP、OCN、Runx2的mRNA表達(dá)水平較正常BMSCs組及空載對(duì)照組表達(dá)明顯下降(圖5)，說明S100A16抑制成骨分化。

圖5 細(xì)胞成骨分化相關(guān)因子mRNA的表達(dá)情況ALP.堿性磷酸酶；OCN.骨鈣素；Runx2.Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄核心因子2；*P<0.05

6.茜素紅染色觀察各組細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)形成情況：各組BMSCs成骨誘導(dǎo)分化21天，茜素紅染色顯示S100A16過表達(dá)組(PLJM1-S100A16-GFP-BMSCs)礦化結(jié)節(jié)形成較正常BMSCs組和空載對(duì)照組明顯減少(圖6)。

圖6 各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況(×200)A.正常BMSCs組；B.空載對(duì)照組；C.S100A16過表達(dá)組

討 論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與年齡、性別、環(huán)境、遺傳等相關(guān)的退行性疾病，主要的危害就是發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[8,9]。近年來，國家重點(diǎn)宣傳“全民健康，三減三健”的主題，其中包括健康骨骼，骨質(zhì)疏松是全民需要重視的問題。骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的髖部骨折被稱為是“人生最后一次骨折”，我國骨質(zhì)疏松癥患者髖部骨折的平均年齡是67.2歲，每年醫(yī)療費(fèi)用估計(jì)需要150億元人民幣[10,11]。因此，骨質(zhì)疏松給家庭和社會(huì)都帶來了極大的負(fù)擔(dān)和壓力，這是現(xiàn)代人口老齡化社會(huì)的一個(gè)亟需解決的健康問題，需要有效的防治策略。骨質(zhì)疏松的主要致病因素是骨吸收增強(qiáng)和骨形成能力減弱。成骨細(xì)胞分化在調(diào)控骨形成中發(fā)揮重要作用，也是目前研究的熱點(diǎn)。本研究通過探討S100A16與成骨分化的相關(guān)性為骨質(zhì)疏松癥的早期診斷分子標(biāo)志物的篩選及分子靶向治療提供新的思路。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，在BMSCs分化過程中，成脂分化和成骨分化呈負(fù)相關(guān)，成脂-成骨分化狀態(tài)依賴于多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路共同調(diào)控[12]。S100A16是筆者課題組在前期對(duì)肥胖相關(guān)基因研究中通過基因芯片篩查到的差異表達(dá)基因。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，S100A16能夠促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)合成集聚從而導(dǎo)致肥胖發(fā)生[13,14]。另有研究顯示，肥胖患者脂肪分化增加、成骨分化減少，成骨細(xì)胞被脂肪細(xì)胞替代、骨髓被脂肪填充致骨礦化密度下降可引發(fā)骨質(zhì)疏松傾向[15,16]。而骨質(zhì)疏松癥患者骨量減少的同時(shí)伴有骨髓脂肪組織增加致骨礦化密度下降[17]。這些均提示S100A16在促進(jìn)脂肪分化同時(shí)抑制成骨分化，筆者推測(cè)S100A16與成骨分化呈負(fù)相關(guān)。目前S100A16作為促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和形成的關(guān)鍵因子，是否影響且如何影響成骨分化無相關(guān)報(bào)道。

為此，本研究首先進(jìn)行了S100A16的表達(dá)與成骨分化的生物信息學(xué)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，S100A16基因在骨髓中的表達(dá)顯著低于其他組織，提示其與成骨呈負(fù)相關(guān)；S100A16基因在經(jīng)曲古抑菌素A誘導(dǎo)成骨分化細(xì)胞中表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著降低，提示S100A16表達(dá)與成骨細(xì)胞分化呈負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證S100A16與成骨分化的相關(guān)性，首先分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示，CD44、CD90和CD105的陽性率均大于90%，CD14、CD34和CD45呈陰性表達(dá)，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。筆者構(gòu)建S100A16高表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)成骨分化，研究S100A16對(duì)成骨分化的影響。從蛋白水平驗(yàn)證S100A16穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。與正常BMSCs組和空載對(duì)照組比較，S100A16高表達(dá)下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化過程中成骨分化相關(guān)因子堿性磷酸酶、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄核心因子 2的表達(dá)。礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分化成熟的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，通過茜素紅染色筆者觀察到S100A16高表達(dá)組礦化結(jié)節(jié)明顯少于空載對(duì)照組，說明S100A16抑制成骨分化。因此，筆者推測(cè)S100A16通過調(diào)控成骨細(xì)胞的分化而促使骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展。目前缺乏關(guān)于S100A16參與成骨細(xì)胞分化及骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究，因此兩者關(guān)系及其作用機(jī)制還需進(jìn)一步基礎(chǔ)研究及后續(xù)隨機(jī)、多中心的大樣本量分析加以論證和核實(shí)。

綜上所述，生物信息學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，S100A16表達(dá)與成骨分化呈負(fù)相關(guān)，它作為全新的成骨分化呈負(fù)性調(diào)控因子可能是抗骨質(zhì)疏松的潛在治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步探索。本研究的意義在于豐富成骨分化和骨質(zhì)疏松理論基礎(chǔ)研究的同時(shí)，也將為骨質(zhì)疏松癥的篩查及防治提供新的研究方向。