張萌，李娜，謝麗，郝亮，熊海濤，吳迎春

(陜西理工大學 化學與環(huán)境科學學院，陜西 漢中，723001)

煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是人體內一種內源性物質，它參與細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，細胞能量轉化的重要輔酶]的合成[1]，研究[2]發(fā)現(xiàn)人體的衰老過程伴隨著體內NAD+含量的減少，作為人體NAD+合成的有效補救途徑，服用NMN可以延緩細胞衰老的過程、從而實現(xiàn)抗衰老的效果。NMN作為新一代的抗衰老因子[3]，市場上相繼出現(xiàn)了相關的保健品、化妝品和加工食品等，其工業(yè)合成和產(chǎn)品開發(fā)過程中對于原料中NMN含量和雜質控制要求嚴格，在未來的實際生產(chǎn)中，一種高效的NMN含量檢測方法對其質量控制具有重要意義。目前NMN的檢測方法主要有定量核磁共振法[3]和液質聯(lián)用法[4]，但食品樣品的基質與組成相當?shù)膹碗s，在液質實際分析中存在很嚴重的基質效應[5-6]，改善前處理方法純化樣品是最有效、最徹底消除基質效應的方法[7]。

固相萃取(solid-phase extraction,SPE)是目前最常用的樣品前處理方法之一[8]，但常規(guī)的固相萃取吸附劑主要依靠非特異性作用力吸附目標物，對復雜樣品很難進行凈化和富集。近年來，分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)因其預定性、實用性以及識別性等優(yōu)點[9-13]而被廣泛地應用到固相萃取領域[14-18]。以MIPs作為固相萃取的填料，制備分子印跡固相萃取(molecularly imprinted solid-phase extraction，MISPE)柱，該柱對模板分子有特異性識別能力，非常適合分離富集復雜樣品中痕量分析物，提高儀器的靈敏度和準確度[19-22]。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)有關NMN MIPs的相關研究。本實驗以NMN為模板分子，α-甲基丙烯酸(methylacrylic acid，MAA)為功能單體，采用沉淀聚合法制備NMN MIPs微球，測定其吸附性和選擇性，并利用MIPs對西蘭花中的NMN進行固相萃取研究，實現(xiàn)了NMN的分離富集，為復雜樣品中NMN的分析測定提供了新的樣品前處理技術。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

NMN標準品，上海源葉生物科技有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate，EDGMA)，深圳市麗晶生化科技有限公司；MAA，天津市福晨化學試劑廠；偶氮二異丁腈(2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN)，成都市科龍化工試劑廠；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺，天津市科密歐化學試劑有限公司；實驗試劑均為分析純。

SPD-16高效液相色譜儀，日本島津公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 NMN MIPs的制備

取0.4 mmol NMN，溶于一定的溶劑中，然后加入0.8 mmol MAA，5 ℃下預聚合10 h，然后加入4 mmolN,N′-亞甲基雙丙烯酰胺和50 mg AIBN，除氧、密封，60 ℃下反應7 h。聚合完成后，離心，棄上清液，得白色印跡聚合物。水洗去除未反應的NMN、MAA和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺等，然后用甲醇乙酸(體積比9∶1)作為脫模液，去除印跡聚合物中的NMN，再用甲醇洗去殘留的乙酸，真空干燥，得NMN MIPs。

非印跡聚合物(non-imprinted polymers，NIPs)的合成方法與MIPs合成方法一致，只是在合成時不加入NMN。

1.3 MIPs的吸附性能

1.3.1 標準曲線的繪制

以乙腈水為溶劑，配制質量濃度為3.125～100 μg/mL的NMN標準溶液，用HPLC儀測定不同濃度下NMN溶液的峰面積，平行測定3次，取平均值。從峰面積(F)-濃度(c)曲線圖得到F-c關系式：F=7 810 934 129.353 2c-26 205.442 8，R2=0.997 4。

HPLC測定條件[4]：島津Essentia LC-16色譜柱；紫外檢測波長為261 nm；流動相A為2 mmol/L醋酸銨甲醇溶液、B為0.1%乙酸水溶液；泵的總流速=1 mL/min、泵A∶泵B=1∶4；柱溫箱溫度為室溫。

1.3.2 靜態(tài)等溫吸附

準確稱取2 mg MIPs和NIPs，加入2 mL不同濃度的NMN標準溶液，恒溫振蕩4 h，離心，上清液過0.45 μm濾膜，用HPLC測定其濃度，并繪制吸附等溫線。吸附量(Q)的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Q為MIPs(或NIPs)對NMN的吸附量,mg/g；c0為溶液中NMN的初始質量濃度,mg/mL；ce為吸附平衡時NMN的質量濃度,mg/mL；V為NMN溶液的體積,mL；m為MIPs(或NIPs)的質量,g。

1.3.3 吸附動力學

分別稱取2 mg MIPs和NIPs，加入2 mL 100 μg/mL的NMN標準溶液，恒溫振蕩不同時間，離心，上清液過0.45 μm濾膜，用HPLC測定其濃度。采用準一級動力學方程和準二級動力學方程研究MIPs對NMN的吸附速率和吸附機理，準一級動力學方程和準二級動力學方程如公式(2)、公式(3)所示：

ln(Qe-Qt)=lnQe-k1t

(2)

(3)

式中：Qe為MIPs(或NIPs)平衡時的吸附量,mg/g；Qt為測量時間為t時MIPs(或NIPs)的吸附量,mg/g；t為吸附時間,min；k1為一級動力學常數(shù)；k2為二級動力學常數(shù)。

1.3.4 選擇性吸附

準確稱取2 mg MIPs，加入2 mL一定濃度的NMN、煙酰胺、腺苷酸標準溶液，恒溫振蕩4 h，離心，上清液用0.45 μm濾頭過濾，用HPLC測定其濃度。3種被測物結構如圖1所示。

A-NMN;B-煙酰胺；C-腺苷酸圖1 NMN、煙酰胺和腺苷酸結構Fig.1 The structure of NMN,nicotinamide and adenylate

印跡因子(imprinting factor，IF)、分離因子(α)和相對分離因子(β)的計算公式如公式(4)～公式(6)所示。IF值越大，說明制備的MIPs的印跡效果越好；α值越大說明印跡材料對NMN的選擇和識別能力越強；β值越大說明與NIPs相比，MIPs對印跡分子NMN的特異性吸附能力越強。

(4)

(5)

(6)

式中：Qi為MIPs(或NIPs)對NMN的吸附量，mg/g；Qj為MIPs(或NIPs)對NMN結構類似物(腺苷酸、煙酰胺)的吸附量，mg/g；αM表明相比于NMN結構類似物，MIPs對NMN的吸附效果；αN表明相比于NMN結構類似物，NIPs對NMN的吸附效果。

1.4 MISPE

用MIPs作填充材料制備MISPE柱。準確稱取一定質量的MIPs，裝入1 mL的固相萃取柱(Agilent)中，用篩板壓嚴實。用乙腈水對MISPE柱進行活化，然后加入一定體積的西蘭花提取液吸附一定時間后，進行淋洗和洗脫，分別收集上樣液和洗脫液，進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 MIPs制備條件的優(yōu)化

2.1.1 溶劑的用量

模板分子NMN與功能單體MAA的預聚合是利用氫鍵作用力，制備的MIPs屬于非共價型，反應溶劑對氫鍵作用力以及MIPs的形態(tài)影響較大，且具有致孔作用。所用溶劑不僅要對NMN有較高的溶解度，還要能夠促進NMN與MAA之間氫鍵的形成。NMN屬于水溶性物質，在水中有較好的溶解度，且MAA和交聯(lián)劑N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺在水中也有較好的溶解度，故選擇水作為溶劑。但考慮到水會對氫鍵產(chǎn)生破壞，影響選擇性空穴的形成，故采用混合溶劑，考慮到N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺在乙腈中也有較好的溶解度，且乙腈的極性與介電常數(shù)均低于水、對氫鍵的形成影響較小，乙腈與水可無限互溶，故溶劑選擇乙腈水。此外，在MIPs的制備過程中，溶劑的用量也十分關鍵，當溶劑的量太少時，反應物黏度大、反應更趨向于本體聚合；當溶劑的量太大時，則無法形成微球沉淀。因此，溶劑的配比和用量至關重要，需對其進行優(yōu)化。固定水的體積為3 mL，使得水與乙腈的體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4。結果如圖2所示，當溶劑量為12 mL(即水3 mL，乙腈9 mL，水與乙腈的體積比為1∶3)時，MIPs吸附效果最好，可達到23.95 mg/g。

圖2 溶劑用量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of solvent usage

2.1.2 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的用量

沉淀聚合法制備NMN MIPs主要分為2個階段：首先，在一定溶劑中，NMN與MAA通過氫鍵作用形成預聚體；然后AIBN分解產(chǎn)生自由基引發(fā)聚合，N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺使預聚體形成高度交聯(lián)、剛性的聚合物。因此，NMN、MAA和N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的用量在MIPs的制備過程中至關重要。故對每個變量設置3個水平，研究其對MIPs吸附性能的影響。正交分析見表1，方差分析見表2。MIPs制備過程中影響聚合物吸附性能的各因素主次為B(功能單體MAA)>A(模板分子NMN)>C(交聯(lián)劑N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺)，說明在MIPs的制備過程中MAA的用量對MIPs的吸附性能影響最大，N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的用量對其影響最小。根據(jù)各主次因素的最高水平，得出的最優(yōu)MIPs的制備方案為A2B2C2，即模板分子NMN的用量為0.04 mmol、功能單體MAA的用量為0.08 mmol、交聯(lián)劑N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的用量為0.4 mmol(其摩爾比為1∶2∶10)為最優(yōu)制備MIPs的條件組合。

表1 正交實驗優(yōu)化結果Table 1 Orthogonal experiment optimization results

表2 正交實驗方差分析Table 2 Orthogonal experiment analysis of variance

2.2 聚合物吸附性能

2.2.1 靜態(tài)吸附等溫線

為考察聚合物對NMN的平衡吸附能力，繪制吸附量(Q)隨NMN濃度(c)的變化曲線，結果如圖3所示，在10～70 μg/mL，MIPs和NIPs的吸附量均隨著NMN濃度的增大而增大；而在70 μg/mL以后，曲線逐漸趨于平穩(wěn)。MIPs的整體吸附量均要大于NIPs，表明MIPs的吸附性能顯著強于NIPs。

圖3 MIPs和NIPs對NMN的靜態(tài)吸附等溫線Fig.3 Static adsorption isotherms of MIPs and NIPs to NMN

2.2.2 吸附動力學

對NMN MIPs和NIPs進行動力學測試，繪制吸附量(Q)隨吸附時間(t)的變化曲線，結果如圖4所示。在0～60 min，MIPs與NIPs曲線均呈上升趨勢，在60 min左右達到平衡；并且 MIPs的吸附量明顯高于NIPs。這是因為MIPs的“空穴”被NMN成功印跡，隨著吸附時間的增加，MIPs中的空穴逐漸被NMN填充，空間位阻增大、吸附速率降低，最終達到動態(tài)平衡。而NIPs沒有特定的印跡空穴，所以只能依靠聚合物表面的非特異性吸附作用進行少量的吸附。

圖4 MIPs、NIPs的動態(tài)吸附曲線Fig.4 Dynamic adsorption curves of MIPs and NIPs

為了進一步探究MIPs和NIPs吸附過程的動力學機理，采取準一級動力學模型和準二級動力學模型進行擬合。準一級動力學方程和準二級動力學方程的擬合結果見表3，MIPs、NIPs的準二級動力學方程的擬合結果相關系數(shù)R2(0.983 5、0.984 8)均比準一級動力學方程的R2(0.929 8、0.939 7)更接近1，說明MIPs、NIPs對NMN的吸附過程更符合準二級動力學方程。

表3 動力學方程擬合參數(shù)Table 3 Kinetic equation fitting parameters

2.2.3 選擇性吸附

選取與NMN結構類似的腺苷酸和煙酰胺作為底物進行選擇性吸附研究，結果見表4。IF為1.36，說明制備的MIPs具有較好的印跡效果；在有印跡分子結構類似物(腺苷酸、煙酰胺)的存在下，分離因子α均>1，說明印跡材料對NMN的選擇和識別能力很好；此外，NMN與腺苷酸、煙酰胺的相對分離因子β(2.81、2.83)均>1，可見與NIPs相比，MIPs對NMN有著較強的特異性吸附能力。

表4 MIPs的選擇性吸附Table 4 Selective adsorption of molecularly imprinted polymers

2.3 固相萃取柱的制備及其應用

研究了MISPE西蘭花提取液中NMN的實際應用效能。取適量西蘭花提取液加入到MISPE柱中，用乙腈作為淋洗液、甲醇乙酸(體積比9∶1)作為脫模液，收集洗脫液，采用HPLC分析其組成。西蘭花提取液和過MISPE柱洗脫液的色譜圖如圖5所示，可以看出，NMN的色譜峰顯著增高，雜質色譜峰顯著降低或消失，說明該柱對NMN具有很好的選擇性，可以從復雜基質中分離富集NMN。

A-西蘭花提取液；B-西蘭花提取液經(jīng)MISPE處理后的洗脫液圖5 MISPE西蘭花樣品吸附凈化效果譜圖Fig.5 Spectrum of adsorption and purification effect of molecularly imprinted solid phase extraction broccoli sample

2.4 加標回收率和精密度

在1.4固相萃取條件下，采用加標回收法，在西蘭花提取液中加入1 mL不同濃度的NMN標準液，旋勻，使其加標質量濃度分別為5、50、200 μg/mL，每個濃度水平測定5次，實驗結果如表5所示，西蘭花中NMN的回收率為89.52%～95.77%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)(n=5)為1.08%～5.27%，實驗結果表明該方法具有良好的準確度和精密度。

表5 西蘭花中NMN的加標回收率和精密度Table 5 Recoveries and RSD of NMN in broccoli

2.5 分子印跡的重復使用性能

分子印跡的重復使用性能是評價其實用性的一個重要指標。在5 mL 80 μg/mL的NMN溶液中，加入一定量的MIPs，吸附平衡后離心，HPLC測定上清液中NMN濃度，計算該MIPs的吸附量。然后用一定量的脫模液洗脫吸附在MIPs中的NMN，干燥后，將該MIPs再加入到5 mL 80 μg/mL的NMN溶液中，吸附平衡后測定其吸附量。按照相同的步驟重復測定7次，MIPs的吸附量如圖6所示?？梢钥闯鯩IPs重復使用多次后，吸附性能變化不大，該實驗制備的MIPs可以反復多次使用。

圖6 多次使用后MIPs的吸附量Fig.6 Adsorption capacity of MIPs toward NMN after seven recycles

3 結論

本研究首次以NMN為模板分子、乙腈水為致孔劑、MAA為功能單體、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑、AIBN為引發(fā)劑，采用沉淀聚合法制備了NMN MIPs，并且采用正交試驗優(yōu)化了聚合工藝。當NMN、MAA、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺的摩爾比為1∶2∶10、致孔劑乙腈水用量12 mL、聚合溫度60 ℃時，制備的MIPs吸附效果最好。靜態(tài)吸附結果表明，所制得的MIPs對NMN有較強的吸附能力。動態(tài)吸附結果表明，該MIPs在60 min左右達到吸附平衡；MIPs和NIPs對NMN的吸附過程均符合準二級動力學方程。選擇性吸附實驗結果表明MIPs對NMN有很好的特異性吸附能力。該MIPs用于固相萃取西蘭花提取液中的NMN時，展現(xiàn)了較高的應用性能，為植物中NMN的分離和純化提供了新的方法。