王露露，李 斌，彭雪菲，陳楠楠，曹夢思，劉 明*，郭新光，別小妹

（1 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京 100015 2 南京農業(yè)大學食品科技學院 南京 210095 3 食品行業(yè)生產力促進中心 北京 100015）

納豆是由納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類而成的一類發(fā)酵食品[1]，在發(fā)酵過程中會產生納豆激酶（Nattokinase，NK）、維生素K2、異黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）等活性物質[2]，可以溶解血栓[3]，預防骨質疏松[4]，降血壓[5]，降血脂[6]，減脂助消化[7]，免疫調節(jié)[8]等。納豆芽孢桿菌屬于枯草芽孢桿菌的亞種，研究表明，枯草芽孢桿菌可以有效抑制動物腸道內致病菌[9]，調節(jié)腸道菌群平衡[10]，提高機體免疫力[11]，促進酶類及B 族維生素合成，進而提高食物的消化吸收利用率[12]等。

發(fā)酵食品是否安全，與發(fā)酵菌株和生產工藝密不可分。一般來說，發(fā)酵工藝條件可控，具有較高的安全性，然而，發(fā)酵菌株的安全性、有毒有害代謝產物及雜菌的污染不可避免地會增加食品安全風險[13]。隨著抗生素在人和動物中持續(xù)過度的使用，甚至濫用，腸道致病菌或非致病菌產生耐藥性或攜帶耐藥基因，可傳遞或轉移給腸道內其它細菌，對環(huán)境及人體健康造成威脅[14]。目前細菌的耐藥性儼然成為影響公眾衛(wèi)生安全的問題。然而，大多數耐藥性研究聚焦在致病菌的藥物敏感性，有關非致病菌耐藥性的研究很少，枯草芽孢桿菌與常見抗生素相互作用的研究更是寥寥。納豆及其制品中有大量活性菌隨產品的攝入進入人體，如果其存在可轉移耐藥基因，就有可能引起人體腸道致病菌產生耐藥性，對人體造成安全威脅。

傳統發(fā)酵食品一般不會存在安全性問題，然而，在食品發(fā)酵過程中生物胺（Biogenic Amines，BA）的積累很難控制[15]。適當的BA 對人體的各項生理機能具有調節(jié)作用，當BA 代謝能力飽和或代謝活性被特異性地減弱或抑制時，會在人體內大量積累，可能會發(fā)生食物中毒[16]。目前各國對食品中BA 的限量標準不一，我國尚未對各類食品BA 含量作出要求。王充等[17]對豆豉、豆醬、醬油3種大豆發(fā)酵制品的8 個樣品中生物胺含量進行檢測，發(fā)現50%的樣品中組胺含量超過美國食品藥品監(jiān)督管理局確定的危害水平（500 mg/kg）。Yang等[18]對市售大豆和豆腐中生物胺含量進行研究，發(fā)現30 種發(fā)酵大豆樣品中有8 種存在生物胺不安全性，組胺、酪胺和β-苯乙胺的含量達到威脅人類健康的水平，豆腐中的腐胺含量也存在安全隱患。由此可見，發(fā)酵納豆中也可能存在過量積累BA 的風險。目前有關發(fā)酵豆制品中BA 的研究多集中在發(fā)酵初制品的檢測，缺少終產品中生物胺含量的數據。

本文通過紙片法研究8 種常見抗菌藥物對14 株枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度（MIC 值），采用液相色譜法測定市售納豆及其制品生物胺含量。根據菌株耐藥性和產品的生物胺含量評價納豆及其制品的安全性，為盡快實現其安全性的標準化評價方法提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品 20 種納豆及其制品，購自北京、廣東、西安、大連等市場。

1.1.2 菌株 枯草芽胞桿菌枯草亞種（CICC 10023），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。金黃色葡萄球菌（ATCC29213），本實驗室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 肉湯培養(yǎng)基，用于種子培養(yǎng)；LB 固體培養(yǎng)基，用于菌株劃線純化；MHA（Mueller-Hinton Agar），用于抗生素敏感試驗；PCA（Plate Count Agar），用于平板計數。

1.1.4 試劑 抗菌藥物（環(huán)丙沙星、氯霉素、美羅培南、頭孢他啶、頭孢曲松、氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素），購自中國食品藥品檢定研究院；生物胺標準品（腐胺、尸胺、組胺、2，4，6-三甲基苯乙胺、酪胺、亞精胺、精胺）、1，7-二氨基庚烷內標標準品、丹磺酰氯衍生劑，購自美國Sigma 公司；乙腈（色譜純級），德國CNW Technologies 公司；丙酮（色譜純級），韓國DUKSAN 公司。其余試劑均為國產分析純級。

1.1.5 儀器與設備 恒溫培養(yǎng)箱，德國MEMMERT 公司；GR60DA 高壓滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；MQL-61R 立式振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；CX33 光學顯微鏡，日本Olympus Corporation 公司；HC-3518 高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；T-Gradient 梯度PCR 儀、瓊脂糖凝膠電泳儀，德國BIOMETRA 公司；Waters 2695 液相色譜儀，美國Waters 公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化 稱取10 g 樣品置于均質袋中，加入100 mL 無菌水均質5 min，80 ℃水浴30 min 除去雜菌，冷卻至室溫后取1 mL 上清液進行梯度稀釋，分別取10-4，10-5，10-6，10-74 個梯度在LB 培養(yǎng)基上涂布，每個梯度3 個平行，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取疑似菌株的單菌落至LB 平板連續(xù)劃線至得到大小均一的單個菌落。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學觀察 參照 《伯杰氏細菌鑒定手冊》解釋標準，觀察平板上單個菌落的大小形態(tài)、顏色、表面粗糙度、透明度、邊緣整齊情況等。

1.2.2.2 生理生化鑒定 以枯草芽孢桿菌亞種（CICC 10023）作為對照，按照鑒定芽孢桿菌生理生化鑒定試劑盒的使用說明，進行12 種生理生化試驗，觀察試劑盒內各培養(yǎng)基顏色變化。

1.2.2.3 16S rDNA 鑒定 提取純化的單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用DNA 提取試劑盒提取細菌DNA。以試劑盒提取的DNA 為模板，對其16S rRNA 進行PCR 擴增，采用通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′ ；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR 擴增體系：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.5 μL（10 μmol/L）上下游引物，1 μL 模板DNA，ddH2O 補足到25 μL，進行35 個循環(huán)。

PCR 擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳儀檢測。選擇明亮且清晰準確的條帶DNA 交由生工生物工程股份有限公司進行16S rDNA 雙向測序。對測序結果采用DNA MAN 軟件拼接，登錄NCBI利用Nucleotide BLAST 在線對樣品序列結果進行序列同源性比對，下載數據庫中獲得的同源性比較高的菌株16S rDNA 基因序列信息，獲得菌株的系統發(fā)育地位。

1.2.3 藥物敏感性試驗 將8 種抗菌藥物稀釋成試驗所需的濃度，浸透自制無菌藥敏片（8 mm×0.7 mm），37 ℃烘干備用。將甘油管內保存的菌株活化后，采用麥氏比濁法調整菌液濃度大約至1.5×108CFU/mL，再用生理鹽水稀釋100 倍（大約為105～106CFU/mL）。取100 μL 置于制備好的MHA 培養(yǎng)基，用一次性涂布棒涂至菌液完全被瓊脂吸收，正置30 min，用無菌鑷子夾取各濃度的耐藥紙片平鋪于平板，每個紙片的中心距離＞24 mm，紙片邊緣距平板邊緣＞15 mm，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內孵育18 h。以金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）作為質控菌株，質控菌株和試驗菌株的藥敏試驗結果必須符合美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI） 頒布的最新版M100-2C 抗菌藥物敏感性試驗解釋標準，確定明顯抑制菌株生長的最低抑制濃度（MIC 值）。

1.2.4 生物胺含量檢測

1.2.4.1 樣品的提取 將各樣品研磨至碎，準確稱取5 g，置于50 mL 離心管中，加入10 mL 三氯乙酸超聲提取30 min，6 000 r/min 離心10 min，取上清液轉移至25 mL 容量瓶中，沉淀用10 mL 三氯乙酸重復提取、離心，取上清液轉移至容量瓶后，用三氯乙酸定容至刻度。

1.2.4.2 衍生及測定 樣品及生物胺標準系列溶液的衍生參考GB 5009.208-2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》[19]。

1.2.4.3 色譜條件 色譜柱為C18 柱 （柱長250 mm，柱內徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm），紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動相A：90%乙腈和10%乙酸銨溶液 （0.01 mol/L，含0.1%乙酸），流動相B：10%乙腈和90%乙酸銨溶液（0.01 mol/L，含0.1%乙酸），流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)特征 在納豆及其制品中共分離到14 株菌，編號分別為SD-1～SD-8、SDF-2、SDF-3、SDF-4、SDP-1、SDP-3、SDP-5。菌株的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結果如圖1所示，菌落近似圓形，表面呈乳白色或淺黃色，濕潤有皺褶，不透明，邊緣呈葉齒狀，與培養(yǎng)基緊密結合。菌體顯藍紫色，屬革蘭氏陽性菌，短桿狀，單個或鏈狀排列，菌體內有芽孢。

圖1 菌株的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of strain

2.1.2 生理生化鑒定 如表2所示，14 株菌的生理生化結果與陽性菌株CICC 10023 各項指標相同，符合《伯杰細菌鑒定手冊第8 版》、《常見細菌系統鑒定手冊》中芽孢桿菌的特性描述，結合菌株的形態(tài)特征，可以確定14 株菌為芽孢桿菌屬。

表2 菌株的生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of strains

2.1.3 16 S rDNA 鑒定 利用DNA 基因組提取試劑盒在無菌環(huán)境下提取各菌株的DNA 后，PCR 擴增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，結果顯示其堿基對數目為1 400 bp 左右，說明擴增成功，菌株NDA 擴增條帶如圖2。

圖2 DNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 DNA agarose gel electrophoresis

13 株菌完成了雙向測序，Seq Man 軟件拼接后，各菌株的16S rDNA 全長在1 460 bp 左右。將13 株菌的序列分別使用BLAST 在基因庫中進行同源性在線搜索，確定13 株菌均為枯草芽孢桿菌。

2.2 藥物敏感性試驗

如表3所示，分離到的14 株枯草芽孢桿菌中，只有SD-7 菌株未表現出對任何一種抗菌藥物的耐受性，其它菌均表現出不同程度的耐藥。SD-1、SD-2、SD-4、SD-8、SDF-4、SDP-5 菌株對頭孢他啶表現出高度耐受性，SD-6、SDF-2、SDP-3表現為輕微耐藥性，其余均對頭孢他啶高度敏感。SDF-2 和SDP-1 對環(huán)丙沙星表現出高度耐受性，SD-3 表現為輕微耐藥性，其它均對環(huán)丙沙星敏感。美羅培南對SD-2、SDP-5 的MIC 值為8 μg/mL，表現為輕微耐藥，對其余12 株菌則抑制作用明顯。14 株菌對頭孢曲松和慶大霉素高度敏感，表明均未攜帶頭孢曲松和慶大霉素抗性基因。SD-2、SD-3、SD-7、SDF-2、SDP-1 對氯霉素敏感，其它菌株均表現為輕微耐藥。因為CLSI 中未規(guī)定氨芐西林對芽孢桿菌屬類細菌的MIC 值，8 μg/mL 的質量濃度未觀察到對菌株的抑制作用，無法判定菌株是否耐藥。

表3 常見抗菌藥物對各菌株的MIC 值（μg/mL）及敏感性判斷Table 3 MIC value （μg/mL） and sensitivity judgment of common antimicrobial agents against each strain

2.3 生物胺含量檢測

如圖3所示，7 種生物胺標準品在37 min 內全部出峰，且各生物胺之間都能得到很好的分離，出峰順序及保留時間分別為腐胺18.570 min、尸胺20.201 min、組胺21.319 min、2，4，6-三甲基苯乙胺26.183 min、酪胺28.242 min、亞精胺29.401 min、精胺35.466 min。

圖3 生物胺混合標準品液相色譜圖（25 mg/L）Fig.3 Liquid chromatography of mixed standard of biogenic amines （25 mg/L）

由表4可知，7 種生物胺標準品回歸方程的相關系數R2＞0.9963，說明標準曲線呈良好的線性關系，以3 倍和10 倍的信噪比分別確定7 種生物胺的檢出限和定量限分別在0.033～0.167 mg/L 和0.112～0.558 mg/L，7 種生物胺回收率在90.2%～113%之間。同時進行6 個平行樣品，7 種生物胺的相對標準偏差（RSD）范圍為0.085～0.016 之間，說明該方法具有良好的精密度，所選液相色譜儀能滿足檢測樣品中生物胺含量的要求。

表4 液相色譜法測定生物胺標準品的特征參數Table 4 Characteristic parameters of biogenic amine standards by liquid chromatography

不同產品形式含有的生物胺種類及含量不同，8 種發(fā)酵納豆生物胺總含量范圍在8.48～162.16 mg/kg，8 種納豆中均未檢出2，4，6-三甲基苯乙胺。除ND-5 產品外，其它7 種納豆均未檢出組胺。同樣是發(fā)酵大豆，ND-5 產品生物胺總含量高達162.16 mg/kg，ND-6 產品中生物胺含量僅8.48 mg/kg，每千克樣品生物胺含量相差150 mg之多。6 種納豆凍干粉生物胺含量范圍在2.21～200.91 mg/kg，不同廠家的凍干粉生物胺含量也存在較大的差異。6 種納豆糖果產品中生物胺含量范圍在3.54～21.71 mg/kg，6 種糖果產品中均未檢出組胺和2，4，6-三甲基苯乙胺。根據美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對食品中生物胺限量標準，20 種產品中生物胺含量均未超標，然而，ND-5 腐胺、尸胺含量較高，具有一定的安全風險，要注意控制食用量，過量食用可能影響人體健康。

3 討論

納豆及其制品中的活菌會隨產品的攝入進入人體，一旦產生耐藥性，其耐藥基因極有可能會通過各種方式在不同種、屬水平中產生轉移，使腸道內致病菌產生耐藥性[20]，同時枯草芽孢桿菌的益生作用也會逐漸被抑制，對人體健康造成威脅。本研究首次開展了分離市售納豆及其制品中的優(yōu)勢菌株，通過制備不同質量濃度梯度的抗生素，研究8 種常見抗菌藥物對產品優(yōu)勢菌的MIC 值。除SD-7 菌株外，其它菌均有不同程度的耐藥，在檢測菌株中有6 株對頭孢他啶藥物表現出高度耐受性，兩株對環(huán)丙沙星耐受，9 株對氯霉素輕微耐藥，說明菌株中可能存在這幾類抗菌藥物的耐受基因，因此，攝入含枯草芽孢桿菌的產品時，應注意和其敏感抗菌藥物分開食用，同時需加強產品生產菌的耐藥檢測、監(jiān)督、管理及控制。下一步可以根據報道的文獻，研究不同菌株對不同藥物的耐藥機制及其耐藥基因的轉移規(guī)律，完善產品的食用安全性評價。

表5 樣品生物胺含量測定結果（mg/kg）Table 5 Results of biogenic amines in sample groups （mg/kg）

納豆發(fā)酵造成生物胺的累積不僅影響納豆的風味和口感，在一定的條件下還可能轉化成強致癌的亞硝胺，過量攝入會影響人體健康[21]。目前國內沒有納豆及其制品生物胺限量標準，同時有關研究中缺少關于終產品中生物胺含量的數據，本研究中以納豆及其制品為研究對象，通過對產品中生物胺含量檢測發(fā)現，同種產品形式生物胺含量存在較大差異，可能與選擇的菌株與加工工藝有關。不同產品形式中生物胺種類及含量存在差異，納豆糖果產品相對比發(fā)酵納豆而言，生物胺含量減少，這可能與終產品加工過程中發(fā)酵菌株的總數減少有關，進一步說明影響生物胺產生的一個重要因素是發(fā)酵的微生物種類及數量。參照美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對食品中生物胺限量標準，各產品生物胺總含量雖然沒有超標現象，但個別產品的生物胺含量具有一定的安全風險，有必要建立納豆制品中生物胺含量限值。

以上結果表明，發(fā)酵納豆類產品是具有安全風險的，應該重視發(fā)酵產品可能存在和產生的致病基因以及毒性代謝產物帶來的風險。完善納豆及其制品安全性的評價方法，開展產品發(fā)酵菌株耐藥性研究和生物胺含量的檢測是納豆及其制品安全性的重要評價手段，將為提高產品的食用安全性提供保障。