常 江，鞏 雪，孫智慧

（1 哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院 哈爾濱 150028 2 哈爾濱商業(yè)大學輕工學院 哈爾濱 150028 3 哈爾濱商業(yè)大學高教發(fā)展研究中心 哈爾濱 150028）

隨著人們健康意識的不斷增強，扇貝因高營養(yǎng)、低脂肪的特性而受到更多的青睞，在我國的沿海地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖。閉殼肌是扇貝主要的食用部分，又被稱為瑤柱，因富含琥珀酸和己氨酸等鮮味氨基酸而使其味道鮮美至極，又因其肉質細嫩、色澤潔白、營養(yǎng)豐富，而被譽為“天下絕品”[1-3]。干制后的閉殼肌更被人們列為“八珍之一”。閉殼肌具有非常豐富的營養(yǎng)以及重要的食用價值，如何保證加工過程中閉殼肌的外觀完整、營養(yǎng)成分不丟失和不被破壞已成為生產(chǎn)過程中的關鍵問題[4]。

超高壓技術應用于水產(chǎn)品領域始于殺菌處理工序，研究人員發(fā)現(xiàn)在壓力升高的過程中，食品中像水分子一樣的小分子間距減小，而由蛋白質等大分子構成的成分結構保持不變[5-7]。此時，在充填和滲透作用下，水分子會進入大分子基團內部，并黏附在蛋白質的氨基酸周邊，破壞蛋白質三級結構中的非共價鍵[8-9]；而在卸壓過程中，壓力由高壓逐漸降為常壓，已變性的蛋白質分子的分子鏈會伸展開來，使原有的立體結構發(fā)生改變，肌肉纖維和黏連組織松懈[10-11]，然而，超高壓處理只會改變大分子中的非共價鍵結構，極大限度地保持了小分子的共價鍵結構，也保護食品的天然品質和營養(yǎng)價值[12-13]。

扇貝以閉殼肌為主要肌肉組織，并直接與貝殼緊密連接，要實現(xiàn)扇貝的脫殼，就必須破壞扇貝貝殼與閉殼肌之間的連接關系，探究閉殼肌在超高壓作用下的結構和特性的變化對扇貝脫殼有著十分重要的影響。閉殼肌的主要成分為肌原纖維蛋白和少量的膠原蛋白，在超高壓作用下，蛋白質是否會發(fā)生變性，對扇貝閉殼肌與界面的連接強度有較大影響。利用拉曼光譜對經(jīng)過超高壓處理的扇貝閉殼肌中蛋白質的結構進行分析，可以為閉殼肌在超高壓作用下的力學性能和深入分析扇貝超高壓脫殼機理奠定理論基礎。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原料 以購于錦州渤海大學海鮮市場的扇貝為研究對象，受超高壓設備入口限制，扇貝的最長軸直徑約（95±5）mm。

1.1.2 試樣預處理 將扇貝表面清洗干凈，將扇貝放入注入淡鹽水的PE 包裝袋并封口后置入超高壓處理設備，施加300 MPa 的試驗壓力分別保持1，2 min 和3 min 后取出，將扇貝貝殼與閉殼肌分離，取與貝殼連接界面位置的閉殼肌作為試樣進行研究。

1.1.3 試劑及設備 2.5%戊二醛固定溶液，南京森貝伽生物科技有限公司；0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液，上海躍騰生物技術有限公司；乙醇，天津市津東天正精細化學試劑廠。

HPP.L2-600 型超高壓處理設備，天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；S-4800 型場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；LabRAM HR Evolution拉曼光譜分析儀，法國HORIBA Jobin Yvon 公司；ALPHA1-2LD plus 冷凍干燥機，德國Martin Christ 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 拉曼光譜分析 將經(jīng)過超高壓處理并與貝殼分離后的界面閉殼肌縱切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的小塊，設置拉曼光譜分析儀的狹縫為200 μm，功率129 mW，激發(fā)波長為515.4 nm，曝光時間60 s，檢測的波長范圍為400～4 000 cm-1，根據(jù)測得數(shù)值繪制拉曼光譜，利用Labspec5.0 軟件進行處理后再經(jīng)Alix 軟件進行分峰擬合，計算得到蛋白質中各二級結構的質量分數(shù)。

1.2.2 掃描電鏡分析 將處理好的試樣用體積分數(shù)2.5%的戊二醛溶液固定24 h，取出后用0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次10 min，然后分別用50%～100%的乙醇梯度洗脫，每次10 min，置入冷凍干燥機干燥后進行離子漸射鍍金，在場發(fā)射掃描電鏡下進行觀察、取像[14]。

2 結果與分析

2.1 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌蛋白質主鏈結構的變化

由圖1可見，共有11 個特征峰出現(xiàn)在扇貝界面閉殼肌的拉曼光譜圖上，這些特征峰主要集中500～1 800 cm-1的指紋圖譜區(qū)和2 800～3 050 cm-1的C-H 伸縮振動區(qū)，通過分析扇貝界面閉殼肌在這兩段拉曼譜帶特征峰的峰形、峰強等參數(shù)的變化，可以得到不同超高壓處理條件對扇貝界面閉殼肌結構的影響[15-17]。扇貝閉殼肌拉曼光譜特征譜帶的歸屬[18-20]如表1所示。

圖1 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of adductor muscle at scallop interface under different holding time

表1 扇貝閉殼肌拉曼光譜特征譜帶歸屬明細表Table 1 Detailed list of characteristic bands of Raman spectra of adductor muscle of scallop

根據(jù)圖1可以看出，不同保壓時間處理后的扇貝界面閉殼肌的拉曼光譜圖特征峰的形狀在2 min 時發(fā)生了非常明顯的變化，其它試驗條件產(chǎn)生的拉曼光譜圖的形狀基本未發(fā)生變化，各特征峰的出峰位置也未發(fā)生大范圍偏移，然而峰強有了比較明顯的差別。在保壓時間為2 min 時，扇貝界面閉殼肌蛋的拉曼光譜比較陡峭，主要原因可能是在這個處理條件下，蛋白質多肽鏈間的分子作用變化比較明顯，蛋白質發(fā)生了較大程度的變性。然而，當保壓時間延長至3 min 時，扇貝界面閉殼肌蛋白質的拉曼光譜圖和初始狀態(tài)比較接近，持續(xù)的超高壓力并沒有加劇蛋白質的變性和結構的松散程度，反而促進了多肽鏈間氫鍵的形成，使蛋白質結構重新變成了有序結構[21-23]。

在圖1中，1 335 cm-1處酰胺Ⅲ帶和1 657 cm-1處酰胺Ⅰ帶的特征峰強度隨著壓力的升高而增大，這2 個位置集中體現(xiàn)著蛋白質多肽鏈中的各種振動伸縮狀態(tài)，說明在壓力作用下，蛋白質分子間的化學鍵振動作用比較明顯，形成了較多新的氫鍵；942 cm-1處的α-螺旋結構特征峰在壓力作用下，峰強度明顯增大，這說明較長的保壓時間可以促進氫鍵的產(chǎn)生，這可能是由于在卸壓過程中，蛋白質發(fā)生了可逆反應，造成了氫鍵的重新形成，提高了α-螺旋結構的含量，使得這一位置的特征峰強度增大。

2.2 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌蛋白質二級結構變化

將得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)利用Labspec5.0 軟件進行處理后，對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，利用Alix 計算軟件對處理后的數(shù)據(jù)進行分峰處理，根據(jù)所得的峰面積計算出蛋白質的二級結構的質量分數(shù)[24]，分析得到了不同超高壓處理條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質二級結構的變化規(guī)律，如圖2所示。

圖2 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌蛋白質酰胺Ⅰ區(qū)分峰擬合曲線Fig.2 Peak fitting curve of protein amide I region in the adductor muscle of scallop under different pressure holding time

根據(jù)圖2所示的各處理扇貝界面閉殼肌在酰胺Ⅰ區(qū)的分峰和迭代擬合曲線，通過對比蛋白質中的α-螺旋（α-Helix）、β-折疊（β-Sheet）、β-轉角（β-Turn）和無規(guī)則卷曲（Random coil）所對應的峰面積，得到了扇貝界面位置閉殼肌蛋白質所包含的各二級結構的質量分數(shù)，在不同保壓時間的條件下，蛋白質的主要二級結構質量分數(shù)如圖3所示。

由圖3可以看出，當試驗壓力為300 MPa 時，保壓時間的延長使得蛋白質的變性程度急劇增強，各個二級結構的主要成分發(fā)生了非常明顯的規(guī)律性變化。在保壓時間延長的過程中，蛋白質二級結構中的α-螺旋結構含量大幅度減少、β-折疊結構、β-轉角結構和無規(guī)則卷曲結構的含量有所增加，這說明蛋白質發(fā)生了比較明顯的變性，生物活性和水溶性也會隨之發(fā)生變化。對于α-螺旋結構而言，在300 MPa 的試驗壓力作用于扇貝閉殼肌的瞬間，蛋白質的二級結構就發(fā)生了變化，α-螺旋結構的含量由初始的74.69%逐漸減小，當試驗壓力分別保持1，2 min 和3 min 時，α-螺旋結構的含量分別為69.22%，57.92%和52.81%，對應初始數(shù)值分別減小了5.47%，16.77%和21.88%。由此可以看出，當保壓時間為2 min 和3 min 時，α-螺旋結構大幅度減少，說明在這個試驗條件下，多肽鏈間的氫鍵穩(wěn)定性減弱，一部分螺旋結構被伸長，轉變?yōu)棣?折疊結構。當保壓時間為1 min 時，β-折疊結構含量的增幅并不是很大，由初始的4.54%增大到了8.72%，提高了92.07%；然而當保壓時間延長至3 min 時，β-折疊結構的含量為21.30%，此試驗條件將蛋白質中的β-折疊結構的含量提高了369.16%，也就是提高了近4 倍，說明蛋白質被伸展的程度是比較大的，扇貝界面位置閉殼肌蛋白質由卷曲結構逐漸轉變?yōu)槠瑢咏Y構，蛋白質的穩(wěn)定性逐漸減弱，分子極性增大，水溶性增加。隨著保壓時間的延長，蛋白質二級結構中的β-轉角結構的含量雖有所增大，但增加的幅度較小，由初始的12.15%增加到了保壓時間為3 min 時的15.57%，增幅為28.15%，說明在300 MPa 的試驗壓力下，一部分肽鏈骨架以180°回折從而改變了肽鏈的方向和空間構象，使蛋白質的生物性能產(chǎn)生了變化。蛋白質中的無規(guī)則卷曲結構的含量也隨著保壓時間的延長而增多，未經(jīng)過處理的扇貝界面閉殼肌中的無規(guī)則卷曲結構的含量為8.62%，當保壓時間為1 min 時，無規(guī)則卷曲結構的含量增加到了9.05%，提高了4.99%；當保壓時間延長至3 min 時，無規(guī)則卷曲結構的含量比未處理扇貝蛋白質中的無規(guī)則卷曲結構含量增加了19.72%，說明在超高壓力的作用下，蛋白質中越來越多的有序結構被破壞而變成了松散的無序結構，蛋白質的變性程度加劇，喪失了部分生物性的功能。

圖3 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌蛋白質二級結構變化Fig.3 Changes of protein secondary structure in adductor muscle of scallop at different holding time

綜上所述，在300 MPa 的試驗壓力下，保壓時間的延長會加劇蛋白質的變性，使蛋白質二級結構中的α-螺旋結構含量降低、β-折疊結構、β-轉角結構和無規(guī)則卷曲結構的含量均有增大，且保壓時間越長，二級結構的變化趨勢越明顯。

2.3 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌蛋白質側鏈構象變化

2.3.1 不同保壓時間下酪氨酸殘基變化 蛋白質中酪氨酸殘基的變化通常通過在830 cm-1和850 cm-1附近的吸收峰響度比值進行衡量，圖4位不同保壓時間下扇貝閉殼肌蛋白質酪氨酸殘基的拉曼特征圖譜。

根據(jù)圖4所示的扇貝界面位置閉殼肌蛋白質中酪氨酸殘基的拉曼光譜圖，在不同的試驗條件下，830 cm-1和850 cm-1附近均出現(xiàn)特征峰。隨著保壓時間地延長，830 cm-1附近的吸收峰強度變化幅度較小，然而850 cm-1附近的吸收峰強度變化比較大，通過計算峰面積得到了這兩處位置所對應的吸收峰強度，并通過吸收峰強度得到了I850/I830的比值，未處理扇貝界面位置閉殼肌蛋白質中酪氨酸殘基在850 cm-1和830 cm-1附近的吸收峰強度的比值為1.037，當對試樣施加超高壓處理時，在保壓時間分別為1，2 min 和3 min 的條件下，I850/I830的比值分別為1.044，1.035，1.092，說明300 MPa 的試驗壓力保持3 min 可使蛋白質的分子結構有比較大的變化，原本包埋于蛋白質分子內部的酪氨酸殘基在多肽鏈表面暴露，與氫鍵之間產(chǎn)生了相互作用。

圖4 不同保壓時間下扇貝界面閉殼肌蛋白質中酪氨酸殘基的變化Fig.4 Changes of tyrosine residues in adductor muscle protein at scallop interface under different holding time

2.3.2 不同保壓時間下色氨酸殘基變化 在拉曼特征圖譜中，755 cm-1附近的吸收峰表示的是蛋白質色氨酸殘基的微環(huán)境狀態(tài)，吸收峰強度反映了色氨酸殘基的暴露狀態(tài)，根據(jù)不同保壓時間條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質的拉曼特征圖譜就可以得到色氨酸殘基所對應的吸收峰強度的變化，進而了解色氨酸殘基的狀態(tài)。

在圖4中呈現(xiàn)了不同試驗條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質中色氨酸殘基的吸收峰特性。隨著保壓時間的延長，拉曼光譜吸收峰強度逐漸減弱，特別是在保壓時間1 min 時，減弱的程度最大，在保壓時間為2 min 和3 min 時又有所反彈，基本與未處理扇貝的色氨酸殘基特征圖譜形狀比較接近，這說明300 MPa 的超高壓力能夠引起色氨酸殘基的暴露，然而長時間保持這種較高的試驗壓力會使蛋白質分子之間發(fā)生微小的可逆變化，使色氨酸殘基的暴露狀態(tài)發(fā)生改變，這主要與蛋白質分子的二級結構和氫鍵間的作用力有關。在不同試驗條件下，扇貝界面閉殼肌蛋白質分子中的色氨酸殘基暴露狀態(tài)改變并不是非常明顯，說明在超高壓力的作用下，色氨酸殘基暴露的程度比較低，并且受試驗條件的影響不是很大。

2.3.3 不同保壓時間下蛋白質C-H 鍵振動作用變化 根據(jù)扇貝界面閉殼肌蛋白質的拉曼光譜圖可以看到，在2 900 cm-1附近出現(xiàn)了一個非常強烈且尖銳的吸收峰，這處吸收峰表征的是蛋白質中C-H 鍵的伸縮振動作用，包括了CH2的非對稱伸縮或者CH3的對稱伸縮振動，即蛋白質的芳香族氨基酸結構及特性的直觀反映。另外在拉曼光譜圖的2 876 cm-1附近還發(fā)現(xiàn)了一個比較微弱的次峰，這個次峰表征的是CH2的非對稱伸縮振動。扇貝界面閉殼肌蛋白質芳香族氨基酸反映在拉曼光譜圖中的吸收峰強度的變化與蛋白質二級結構中α-螺旋結構被拉伸引起的芳香氨基酸C-H 間疏水作用的變化有關，如果在拉曼光譜中表征C-H伸縮振動所對應的拉曼特征峰強度增大，說明羥基在極性微環(huán)境中的暴露程度變大。不同保壓時間下，蛋白質芳香族氨基酸的拉曼光譜如圖5所示。

圖5 不同保壓時間條件下扇貝界面閉殼肌芳香族氨基酸的拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of aromatic amino acids in adductor muscle of scallop at different holding time

由圖5可以看出，在拉曼光譜的2 940 cm-1和2 880 cm-1處存在著2 個比較明顯的吸收峰，特別是2 940 cm-1處的吸收峰非常強烈且尖銳，隨著保壓時間的延長，這兩處的吸收峰強度均有一定程度的增強，特別是當保壓時間延長到2 min 以上時，吸收峰強度增加的幅度非常明顯，說明較長時間保持300 MPa 的試驗壓力可以引起蛋白質分子間氫鍵的變化，導致蛋白質變得更加舒展，使得更多數(shù)量的芳香族氨基酸側鏈暴露在極性環(huán)境中，蛋白質的疏水作用增強。當保壓時間延長至3 min 時，2 940 cm-1處的吸收峰強度有較小程度的減弱，這可能是由于蛋白質長時間處于較高試驗壓力環(huán)境中，當壓力解除時出現(xiàn)了一定的還原作用，即原本被破壞了的氫鍵被修復，使得少量芳香族氨基酸側鏈重新埋藏于蛋白質分子內部，吸收峰強度減弱。

綜上所述，保壓時間的變化會引起芳香族氨基酸側鏈暴露狀態(tài)的改變。當保壓時間為3 min時，會引起蛋白質氫鍵的還原，使少量暴露狀態(tài)的芳香族氨基酸側鏈重新變?yōu)榘駹顟B(tài)。經(jīng)過分析，超高壓力保持2 min 時，對蛋白質二級結構的破壞程度最大，芳香族氨基酸側鏈的暴露程度增加的也最明顯，拉曼光譜所對應的吸收峰增強的幅度最大。

2.3.4 保壓時間對蛋白質二硫鍵的影響 二硫鍵（S-S） 是連接不同肽鏈或同一肽鏈不同部分的化學鍵。它由含硫氨基酸形成，半胱氨酸被氧化成胱氨酸時即形成二硫鍵。蛋白質分子中的二硫鍵起著穩(wěn)定肽鏈空間結構的作用，蛋白質分子的穩(wěn)定性也隨著二硫鍵數(shù)目的增多而增大。當超高壓處理條件變化時，二硫鍵的結構是否發(fā)生變化對明確蛋白質高級結構的穩(wěn)定性有著比較重要的意義。

二硫鍵在拉曼光譜中對應的特征吸收譜在500～550 cm-1區(qū)域內，將這一波數(shù)區(qū)域的拉曼光譜圖進行放大就可以得到不同試驗條件下蛋白質中二硫鍵的拉曼特征圖譜（見圖6）。

由圖6可知，未經(jīng)過處理的扇貝界面閉殼肌蛋白質二硫鍵的特征峰出現(xiàn)在516 cm-1附近，當保壓時間為1 min 時，特征峰位置基本未發(fā)生變化；當保壓時間為2 min 時，特征峰位置向高頻方向移動了9 cm，出現(xiàn)在了525 cm-1附近；當保壓時間為3 min 時，吸收峰又向低頻方向發(fā)生了移動，出現(xiàn)在了520 cm-1附近位置。二硫鍵特征峰位置的變化說明了其構象的變化，當保壓時間為2 min 時，特征峰移動位移最大，已經(jīng)接近了二硫鍵扭式-扭式-反式（g-g-t）構象的臨界區(qū)域，有向反式-扭式-反式（t-g-t）構象轉變的趨勢；然而當保壓時間延長至3 min 時，這種趨勢即刻消失，吸收峰又重新出現(xiàn)在了扭式-扭式-反式（g-g-t）構象的區(qū)域范圍內，這說明長時間的保持較高的試驗壓力會使蛋白質發(fā)生復原現(xiàn)象，原本被破壞了的結構重新得到修復，也使得蛋白質的生物特性得以保持。

圖6 不同保壓時間條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質二硫鍵的拉曼光譜圖Fig.6 Raman spectra of protein disulfide bond in adductor muscle of scallop at different holding time

2.4 超高壓處理對扇貝界面閉殼肌蛋白質影響的掃描電鏡分析

為了研究不同超高壓處理條件對扇貝界面位置閉殼肌的影響，首先對未經(jīng)過處理的扇貝界面位置閉殼肌的形貌進行了掃描，以便進行對比分析，得到的扇貝界面位置閉殼肌的形貌如圖7所示。

圖7 不同保壓時間條件下扇貝界面閉殼肌蛋白質的微觀結構Fig.7 Microstructure of the protein in the interface adductor muscle of scallop under different holding time

由圖7可知，未經(jīng)過處理的扇貝界面位置閉殼肌呈現(xiàn)出比較連續(xù)完整的纖維狀均勻分散，且纖維之間基本保持互相平行分布，形態(tài)具有一定的規(guī)律性。隨著保壓時間的延長，扇貝界面閉殼肌的蛋白質纖維變得短而粗且分布越發(fā)不均勻。當保壓時間延長至3 min 時，閉殼肌纖維原有的柱狀截面纖維變成了扁平的片狀截面，這可能是由于在試驗壓力的作用下，閉殼肌蛋白質中的α-螺旋結構被破壞，氫鍵被打開，螺旋伸展轉變成β-折疊結構。綜上，在不同保壓時間下蛋白質會發(fā)生比較明顯的變性，彈性消失，空間構象發(fā)生變化，增大了貝殼間的作用力，使得閉殼基與貝殼接觸面的拉力增大，引起了閉殼肌-貝殼界面的失效。

3 結論

通過分析300 MPa 的試驗壓力下，不同保壓時間對扇貝界面閉殼肌蛋白質主鏈二級結構、氨基酸側鏈狀態(tài)及二硫鍵的構象的影響，發(fā)現(xiàn)保壓時間比較長的超高壓處理條件下，蛋白質二級結構中的α-螺旋結構含量降低，β-折疊結構、β-轉角結構和無規(guī)則卷曲結構的含量均有增大，酪氨酸在極性環(huán)境中產(chǎn)生了由暴露狀態(tài)向包埋狀態(tài)轉變的趨勢，色氨酸殘基的暴露狀態(tài)無明顯改變。當保壓時間延長時，二硫鍵已經(jīng)到達構象轉變邊界的趨勢得到了還原，使二硫鍵的結構得到了修復；隨著保壓時間的延長，扇貝界面閉殼肌蛋白質中扁平片層狀結構逐漸增多，部分氫鍵被超高壓力破壞后形成了β-轉角結構；另外有部分氫鍵被打開后在相鄰肽鏈主鏈的N-H 和C=O 之間形成了新的有規(guī)則的氫鍵，蛋白質中的β-折疊結構增多，同時由于蛋白質二級結構發(fā)生變化，蛋白質側鏈結構的暴露程度也有所增強。在超高壓力的作用下，蛋白質主鏈和側鏈的結構及空間構象都有了比較明顯的變化，這些結構的變化和狀態(tài)的轉變對閉殼肌的彈性、力學特性、與貝殼之間的結合強度及蛋白質的水溶性都有著非常顯著的影響，這些力學及生物特性的變化也會影響扇貝超高壓脫殼效果，對深入研究扇貝脫殼起到了非常重要的作用。