王倩倩，杜 鵑，馮鳳琴*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058 2 浙江諾衍生物科技有限公司 浙江湖州 313000）

胃潰瘍是常見的胃腸疾病之一，約占世界人口的5%～10%，很難完全治愈，經(jīng)常復(fù)發(fā)[1]。目前胃潰瘍的發(fā)生和復(fù)發(fā)的機(jī)制尚未闡明，人們普遍認(rèn)為幽門螺桿菌感染、膽汁酸、酗酒、非甾體類抗炎藥的使用、缺血、應(yīng)激、壓力、吸煙、衰老和營養(yǎng)不足等外源性因素均可能導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生[2]。臨床上對于胃潰瘍的治療主要以抑酸、增強(qiáng)胃黏膜防御功能為主，以此達(dá)到保護(hù)胃黏膜、控制癥狀、潰瘍修復(fù)以及減少復(fù)發(fā)的目的[3]。雖然大多數(shù)的抗?jié)兯幬锶缳|(zhì)子泵抑制劑、抗酸劑和抗組胺劑的干預(yù)效果令人滿意，但是藥物存在的各種副反應(yīng)限制了它們的應(yīng)用[4-6]。尋找一種能較好修復(fù)胃黏膜組織且副作用小的抗?jié)児δ艹煞?，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

近年來，生物活性肽因良好的吸收性，獨特的生理活性以及安全、無毒副作用的特性成為科學(xué)研究的熱點?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道了幾種肽類物質(zhì)如鱈魚皮膠原肽[7]、核桃肽[8]、小麥肽[9]等對胃黏膜損傷均有一定的保護(hù)作用。海參的干燥體壁含有許多生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，包括約90%的蛋白質(zhì)、6%的多糖、4%的脂類以及多種維生素和礦物質(zhì)，這使得海參成為臨床營養(yǎng)的潛在候選者[10]。從海參中分離出的肽——海參肽（SCP）被證明具有抗氧化[11]、抗炎[12]，促進(jìn)皮膚傷口愈合[13]等作用，然而，目前尚缺乏針對胃黏膜損傷性的研究報道。本文通過建立大鼠切除型皮膚傷口模型，測定傷口的愈合率，觀察海參肽是否能夠促進(jìn)大鼠傷口愈合。在此基礎(chǔ)上，通過觀察觀察胃潰瘍組織學(xué)變化，測定胃潰瘍大鼠胃組織勻漿的抗氧化、抗炎活性及防御因子水平，從多角度研究海參肽對乙酸誘導(dǎo)的胃潰瘍是否有促進(jìn)愈合的作用以及可能的保護(hù)機(jī)制，為開發(fā)海參肽功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF 級Wistar 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量180～220 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供和飼養(yǎng) 【實驗動物許可證編號為SYXK （浙）2018-0012】。

海參肽（從東海野生烏參中分離得到的小分子生活肽類混合物），外觀為淡黃色固體粉末，由杭州康源食品科技有限公司提供。相對分子質(zhì)量小于1 000 u 的低聚肽占90.12%。氨基酸含量為818.61 mg/g，其中呈味氨基酸502.51 mg/g，必須氨基酸95.21 mg/g，疏水性氨基酸174.63 mg/g。

魚皮膠原蛋白粉購于市場；冰乙酸（分析純級，乙酸含量≥99.5%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、表皮生長因子（EGF）的ELISA 檢測試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；BSA224S 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HC-3018R 高速冷凍離心機(jī)，安徽中佳科學(xué)儀器有限公司；Infinite M200Pro 酶標(biāo)儀，瑞士帝肯集團(tuán)公司；DM500 光學(xué)顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海參肽對大鼠皮膚傷口的愈合作用

1.3.1.1 大鼠切除型皮膚傷口模型的建立 根據(jù)來夢婕[14]的方法建立大鼠皮膚創(chuàng)傷模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將10 只Wistar 大鼠麻醉，剪去背部的毛，碘酒消毒。于背部脊柱兩側(cè)旁1 cm 處，用直徑為1 cm 的打孔器蘸紅色印泥標(biāo)記傷口位置，用剪刀在標(biāo)記處制作直徑為1 cm 的圓形皮膚傷口。每側(cè)2 個，每只大鼠共有4 個創(chuàng)口，標(biāo)記為A、B、C、D，分別對應(yīng)空白對照組1（標(biāo)記A，術(shù)后無任何處理，MC-1）、空白對照組2（標(biāo)記B，術(shù)后無任何處理，MC-2）、陽性對照組（標(biāo)記C，術(shù)后涂抹5%的魚皮膠原蛋白溶液，F(xiàn)SC）、海參肽組（標(biāo)記D，術(shù)后涂抹5%的海參肽溶液，SCP），具體造模部位見圖1。將造模后的大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，并將造模當(dāng)天記為第0 天。術(shù)后6 h 按照實驗分組分別用無菌棉簽將配置好的對應(yīng)溶液涂抹傷口處，每日早晚各涂抹一次，連續(xù)2 周。

圖1 大鼠皮膚創(chuàng)傷模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of the skin wound model in rat

1.3.1.2 傷口愈合率測定 分別于術(shù)后第2，4，6，8，10，12 天拍照記錄傷口外表 （拍照時用帶有網(wǎng)格的尺子測量創(chuàng)面的大?。缓罄肞hotoshop軟件計算傷口面積，傷口愈合率的計算公式如下：

1.3.2 海參肽對大鼠乙酸性胃潰瘍的促進(jìn)愈合作用

1.3.2.1 乙酸性胃潰瘍模型的建立及分組 參考保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[15]的方法建立乙酸誘導(dǎo)的胃黏膜損傷模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將40 只Wistar 大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后實施剖腹手術(shù)，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將胃輕柔拉出腹腔外，用微量注射器于胃竇與胃底交界處的黏膜下層注射20 μL 30%冰醋酸，當(dāng)受損部位出現(xiàn)白色潰瘍時表明造模成功，立即縫合切口，碘酒消毒。術(shù)后當(dāng)日給與大鼠禁食不禁水，次日自由飲食、飲水。造模完成后將大鼠隨機(jī)分為4 組（n= 10）：1）空白對照組（NC，未造模，無菌生理鹽水）；2）模型組（MC，無菌生理鹽水）；3）海參肽低劑量組 （SCP-L，0.5 mg/g）；4） 海參肽高劑量組（SCP-H，2 mg/g）。根據(jù)體質(zhì)量給與不同劑量的受試物，灌胃劑量按0.1 mL/10 g，每天1 次，連續(xù)14 d，灌胃期間自由取食和飲水，并定期稱重。

1.3.2.2 損傷程度的評價 末次給藥后，主動脈取血，并于4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，收集上清液置于-80 ℃保存。然后將胃暴露并迅速移出，沿著胃大彎剪開并用冷的生理鹽水洗滌，以除去胃中的內(nèi)容物和血凝塊，用濾紙吸干，并按照如下的方法測量胃黏膜損傷的程度。

1） 潰瘍面積 取胃組織平鋪拍照（拍照時用帶有網(wǎng)格的尺子測量創(chuàng)面的大小），通過Photoshop 軟件計算胃黏膜損傷面積。

2） 潰瘍抑制率 按照如下公式計算損傷抑制率：

將一部分胃組織放于4 ℃的福爾馬林溶液中固定，用于HE 組織病理切片，剩余的部分置于-80 ℃，用于進(jìn)一步分析。

1.3.2.3 生化指標(biāo)的測定 剪取每組大鼠相同部位的胃組織，加入冰的生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，得到10%胃組織勻漿溶液，離心后取上清液用于測定胃組織相關(guān)生化指標(biāo)。胃組織中SOD 活力、GSH-Px 活力和MDA 含量采用南京建成試劑盒說明書測定；胃組織中保護(hù)因子PGE2、NO、EGF水平和血清炎癥因子TNF-α 和IL-6 水平均采用ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析比較組間差異。與空白對照組相比，* 為P < 0.05，** 為P <0.01，***為P<0.001；與模型組相比，#為P<0.05，##為P<0.01，###為P<0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 海參肽對大鼠皮膚傷口的愈合具有促進(jìn)作用

將樣品涂抹在大鼠皮膚傷口上，發(fā)現(xiàn)涂抹魚皮膠原蛋白和海參肽溶液后的第4 天，創(chuàng)傷表面結(jié)痂，無紅腫，空白對照組表面發(fā)炎糜爛（圖2a），此時魚皮膠原蛋白和海參肽組的愈合率分別為39.73%和47.25%，而模型對照組的愈合率為13.42%（空白對照A 和空白對照B 的結(jié)果取平均值得到）。第8 天時，魚皮膠原蛋白和海參肽組痂皮開始剝離傷口，可見新生肉芽組織，此時兩組對應(yīng)的傷口愈合率為83.80%和80.88%，空白對照組的為54.53%（圖2b）。第12 天時，實驗組傷口完全愈合，空白對照組仍可觀察到結(jié)痂傷口；直到第18 天發(fā)現(xiàn)空白對照組傷口完全愈合。類似地，Mei等[16]也證明了鮭魚皮膠原蛋白肽在第12 天時能夠使大鼠皮膚傷口完全封閉。海參肽可以加速傷口的愈合，尤其是在愈合前期表現(xiàn)出極好地促進(jìn)效果。與本文的結(jié)果一致，Li 等[13]發(fā)現(xiàn)灌胃海參低分子質(zhì)量寡肽能夠有效促進(jìn)糖尿病小鼠傷口的愈合，推測可能是由于海參肽干預(yù)后可以減少機(jī)體炎癥反應(yīng)、改善血管生成和膠原沉積，以及抑制氧化應(yīng)激。另外，有研究表明營養(yǎng)在組織愈合中起著至關(guān)重要的作用，它可以通過為傷口血管生成和膠原蛋白合成提供底物和基本能量來加速傷口愈合[16]。本研究所用的海參肽富含必須氨基酸95.21 mg/g 和疏水性氨基酸174.63 mg/g，可能會成為制備臨床上所用的傷口愈合活性肽的理想來源。

2.2 海參肽對大鼠胃潰瘍的愈合具有促進(jìn)作用

2.2.1 海參肽對胃黏膜損傷的影響 潰瘍的愈合包括細(xì)胞增殖、潰瘍邊緣上皮細(xì)胞的復(fù)制以重建腺體結(jié)構(gòu)、潰瘍底部肉芽組織中的血管生成和基質(zhì)沉積[17]。2.1 節(jié)的結(jié)果表明海參肽可能通過提高小鼠的營養(yǎng)狀況從而改善血管生成來促進(jìn)皮膚傷口愈合，推測其對胃潰瘍具有修復(fù)作用。眾所周知，乙酸可引起胃分泌物的腐蝕損傷、胃黏膜的腐蝕和細(xì)胞通透性的改變[18]。通過乙酸注射法制作的胃潰瘍模型造成的潰瘍深而大，且自然愈合周期較長，與人體慢性胃潰瘍的病理狀態(tài)高度相似[19]。本文通過建立大鼠乙酸性胃潰瘍模型來觀察SCP 對胃潰瘍愈合的作用。

胃潰瘍嚴(yán)重程度通常通過潰瘍面積和抑制率來評價。由圖3a 和圖3b 可知，與空白組相比，模型組的潰瘍面積顯著提高（P < 0.001），表明模型構(gòu)建成功。與模型組相比，海參肽低劑量和高劑量組均能極顯著地減小損傷面積（P < 0.001），此時抑制率分別達(dá)到了41.45%和60.41%，而且呈劑量依賴性趨勢。組織切片（圖3c）結(jié)果表明，對照組黏膜層光滑平整，腺細(xì)胞排列整齊，黏膜下層及基層完整，無炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。與空白對照組相比，模型組的正常組織結(jié)構(gòu)消失，黏膜層損傷，有大量的炎性細(xì)胞浸潤。海參肽干預(yù)后，潰瘍得到很大程度的修復(fù)，潰瘍邊緣出現(xiàn)愈合區(qū)。綜合以上結(jié)果可知，海參肽能夠有效減小潰瘍面積，促進(jìn)潰瘍的愈合。

圖3 海參肽對乙酸性胃潰瘍大鼠潰瘍面積、抑制率和組織形態(tài)的影響Fig.3 Effects of SCP on the ulcer area，inhibition rate and morphological structure in the stomach of rats subjected to acetic acid-induced gastric ulcer

2.2.2 海參肽對潰瘍大鼠胃組織氧化應(yīng)激的影響 胃黏膜受乙酸刺激后，活性氧的過表達(dá)可以直接或間接攻擊組織并誘導(dǎo)生物大分子的氧化損傷，并發(fā)生過氧化形成潰瘍。自由基通過產(chǎn)生對細(xì)胞和組織有害的促炎因子，在胃腸道潰瘍和破壞性病變中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生可能導(dǎo)致胃抗氧化防御系統(tǒng)的下降。由圖4可知，與空白對照組相比，模型組的SOD 活性、GSH-Px 活性顯著降低（P<0.01，P<0.05），MDA 含量顯著升高（P<0.01）。華苗爽等[20]發(fā)現(xiàn)乙酸誘導(dǎo)胃黏膜損傷后激活了大鼠胃組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。同樣地，本文數(shù)據(jù)也證明了氧化損傷與潰瘍發(fā)展之間存在相關(guān)性。與模型組相比，海參肽低劑量組和高劑量組胃組織中的SOD 活性提高了3.80%和4.85%，然而差異不顯著（P>0.05）。兩個劑量組中的GSH-Px 活性提高了12.59%和23.54%，且高劑量組達(dá)到了顯著變化（P<0.01），與正常對照組小鼠相比無顯著性差異。同時MDA 含量也顯著降低了59.40%和45.24%（P<0.001），說明海參肽能夠通過減少脂質(zhì)過氧化物MDA 的含量同時增加SOD 和GSHPx 活性來抑制胃組織的氧化應(yīng)激從而促進(jìn)潰瘍的愈合。目前，大量的研究證實了食源性生物活性肽的抗氧化作用與其氨基酸組成、肽序列、長度、電荷、疏水性等密切相關(guān)[21-22]。蛋白或肽中的一些氨基酸殘基，如疏水性氨基酸對其抗氧化活性的貢獻(xiàn)很大[23]。例如，Zhang 等[24]發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶產(chǎn)生的海參肽（A）與抗氧化相關(guān)的氨基酸含量為56.80%，胰蛋白酶產(chǎn)生海參肽（T）含量為47.60%，且肽A 的抗氧化活性大于肽T。結(jié)合本次的研究結(jié)果可以得出海參肽對胃潰瘍的促進(jìn)愈合作用可能與其特殊的氨基酸組成有關(guān)。

圖4 海參肽對乙酸致胃潰瘍大鼠SOD 活力、GSH-Px 活力和MDA 含量的影響Fig.4 Effects of SCP on the SOD activity，GSH-Px activity and MDA content in the stomach of rats subjected to acetic acid-induced gastric ulcer

2.2.3 海參肽對潰瘍大鼠血清中炎癥因子的影響 在黏膜病變形成的過程中，組織會產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6 等。TNF-α 能刺激中性粒細(xì)胞浸潤，減少潰瘍周圍微循環(huán)，延緩胃潰瘍的愈合[25]。IL-6 的過度產(chǎn)生可能激活中性粒細(xì)胞的炎癥部位，從而觸發(fā)氧化應(yīng)激和溶酶體酶，而這些酶是消化性潰瘍疾病中造成組織損傷的原因[26]。此外，這種促炎細(xì)胞因子還可以迅速觸發(fā)NF-κB 的表達(dá)，進(jìn)而激活各種細(xì)胞因子的釋放，從而加劇胃黏膜的損傷[27]，抑制炎性細(xì)胞因子的增加是減輕乙酸誘導(dǎo)所致的胃潰瘍的關(guān)鍵。由圖5可知，與空白對照組相比，模型組的TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P<0.001），提示炎癥反應(yīng)參與了乙酸誘導(dǎo)的胃黏膜損傷，與其它類似的報道結(jié)果一致[28-29]。與模型組相比，經(jīng)過14 d 的干預(yù)后，海參肽低劑量組和高劑量組中的TNF-α 水平降低了12.37%和19.63%，且高劑量組達(dá)到了顯著變化（P<0.05）。同樣地，IL-6 水平也降低了8.64%和23.43%，高劑量組達(dá)到了顯著變化（P < 0.01），說明高劑量的海參肽能明顯抑制促炎因子的產(chǎn)生。綜上，海參肽可能通過抑制促炎因子的形成來改善炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療胃潰瘍的目的。

圖5 海參肽對乙酸致胃潰瘍大鼠TNF-α 和IL-6 水平的影響Fig.5 Effects of SCP on the TNF-α and IL-6 levels in rats subjected to acetic acid-induced gastric ulcer

2.2.4 海參肽對潰瘍大鼠胃黏膜保護(hù)因子的影響 胃黏膜的保護(hù)是修復(fù)和抗損傷的共同作用，內(nèi)源性保護(hù)因子PGE2、NO、EGF 等多種物質(zhì)參與其中。眾所周知，PGE2和NO 參與了胃黏膜完整性的調(diào)節(jié)，并在調(diào)節(jié)胃pH 值和黏液分泌中起重要作用[30-31]。EGF 可通過激活上皮細(xì)胞中Na+/H+的交換促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)，在胃腸黏膜保護(hù)和修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用[32]。為了探究海參肽對胃黏膜損傷的保護(hù)作用是否直接作用于胃黏膜，本文對胃黏膜保護(hù)因子PGE2、NO 和EGF 含量進(jìn)行了測定。由圖6可知，與空白對照組相比，模型組的PGE2、NO 和EGF 含量顯著降低（P < 0.001），表明在潰瘍形成過程中，胃黏膜保護(hù)屏障被破壞。與模型組相比，雖然海參肽低劑量和高劑量組的PGE2和NO 含量分別增加了12.80%，16.95%和14.06%，27.44%，但差異均不顯著（P>0.05），這與仲超逸等[33]的研究結(jié)果相似（其研究結(jié)果表明大果阿魏石油醚提取物對PGE2和NO 這兩個胃黏膜防御因子的增強(qiáng)作用并不顯著，其對胃黏膜損傷的修復(fù)作用主要是由于物質(zhì)本身存在的抗氧化物質(zhì)如乙烯基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚、橙花數(shù)醇等能夠有效地清除自由基，從而提高了胃黏膜的抗氧化能力）。然而，與上述結(jié)果不同的是，兩個劑量組的EGF 含量顯著增加了25.08%（P<0.01）和63.76%（P<0.001）。EGF 含量的增加意味著胃黏膜血液循環(huán)得到改善，同時胃酸和胃蛋白的過量分泌得以抑制[34]。結(jié)果表明，海參肽能顯著增加潰瘍大鼠胃組織中的EGF 含量，增強(qiáng)胃黏膜的防御和修復(fù)功能以保護(hù)胃黏膜，其保護(hù)機(jī)制與胃組織中的PGE2和NO 含量無密切關(guān)。

圖6 海參肽對乙酸致胃潰瘍大鼠PGE2、NO 和EGF 含量的影響Fig.6 Effects of SCP on the PGE2，NO and EGF contents in the stomach of rats subjected to acetic acid-induced gastric ulcer

3 結(jié)論

本研究首先在切除型皮膚傷口模型上發(fā)現(xiàn)了海參肽能夠促進(jìn)大鼠皮膚傷口愈合，然后通過建立乙酸誘導(dǎo)胃潰瘍模型來探究海參肽是否能促進(jìn)胃潰瘍的愈合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海參肽能夠有效的促進(jìn)皮膚傷口的愈合，降低胃潰瘍面積，提高潰瘍抑制率，改善了胃黏膜再生以及減少了炎性細(xì)胞浸潤。同時，海參肽干預(yù)后胃組織中的SOD 活性、GSHPx 活性和EGF 含量顯著增加，MDA 含量、TNF-α水平和IL-6 水平顯著降低。綜上所述，海參肽對胃潰瘍的保護(hù)作用主要是由于存在的抗氧化物質(zhì)能夠有效地清除各種自由基、抑制炎癥因子以及增加防御因子水平，提高了胃黏膜的抗氧化、抗炎能力和防御能力，從多方面、多角度提高胃潰瘍的愈合。因此，海參肽具備開發(fā)為預(yù)防胃潰瘍的功能性食品或膳食補(bǔ)充劑的潛能。