陶 歡， 伯曉晨， 陳河兵*， 鄭曉飛*

(1)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，放射生物學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100850；2)軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院衛(wèi)生勤務(wù)與血液研究所， 北京 100850)

染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用加速了基因組三維結(jié)構(gòu)的探索。細(xì)胞核內(nèi)每條染色體都占據(jù)著一個(gè)獨(dú)特且不重復(fù)的區(qū)域，稱(chēng)為染色體疆域。染色體疆域中包括與常染色質(zhì)和異染色質(zhì)分別相關(guān)的A、B染色質(zhì)區(qū)室，染色質(zhì)區(qū)室由拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(topologically associated domain，TAD)組成，并可進(jìn)一步細(xì)分為染色質(zhì)環(huán)，例如調(diào)控基因表達(dá)的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子環(huán)等[1, 2]。環(huán)擠壓模型認(rèn)為T(mén)AD是由染色質(zhì)環(huán)擠壓形成的，環(huán)狀擠壓因子——黏連蛋白沿著染色質(zhì)移動(dòng)，當(dāng)遇到另一個(gè)擠壓因子或兩個(gè)相反方向的邊界元素——CTCF(CCCTC binding factor，CTCF)時(shí)，將其擠壓成環(huán)，繼而形成TAD[3, 4]。

TAD不僅是DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄的基本功能單位，同樣是DNA損傷修復(fù)的功能單元[5]。已有研究表明，DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)發(fā)生時(shí)，DSB位點(diǎn)的黏連蛋白不斷積累，誘導(dǎo)斷裂位點(diǎn)的單側(cè)環(huán)擠出和擴(kuò)大，并最終被阻滯在TAD邊界，當(dāng)含H2AX的核小體通過(guò)DSB位點(diǎn)錨定的黏連蛋白時(shí)，會(huì)迅速被DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵激酶毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變(ataxia telangiectasia-mutated，ATM)蛋白磷酸化，使TAD內(nèi)部以正確的方式建立γH2AX-53BP1(P53-binding protein 1)染色質(zhì)域，該區(qū)域可作為DNA損傷修復(fù)位點(diǎn)的中心，使γH2AX迅速擴(kuò)散至TAD邊界，在TAD內(nèi)部形成“易于DNA損傷修復(fù)”的環(huán)境，維持基因組三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[5-7]。此外，招募到DSB位點(diǎn)的黏連蛋白將未受損基因隔絕在γH2AX募集區(qū)域外，保護(hù)基因免受染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響，保證基因的正常轉(zhuǎn)錄，這種黏連蛋白依賴(lài)的DNA損傷響應(yīng)機(jī)制從酵母到人類(lèi)均保守，且與DSB修復(fù)途徑無(wú)關(guān)，而募集到TAD邊界的CTCF可以促進(jìn)斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行同源重組修復(fù)[5, 6, 8, 9]。

TAD在不同的細(xì)胞系和物種中具有較高的保守性，其邊界有大量的CTCF和黏連蛋白富集，能夠形成相對(duì)獨(dú)立的局部環(huán)境[6]。近期研究表明，TAD并非是完全獨(dú)立的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部常呈現(xiàn)多層級(jí)結(jié)構(gòu)，與染色質(zhì)的表觀修飾及基因表達(dá)密切相關(guān)[10, 11]。根據(jù)TAD是否具有多層級(jí)結(jié)構(gòu)，可將其分為兩類(lèi)，一類(lèi)是有多層級(jí)的TAD結(jié)構(gòu)，一類(lèi)是無(wú)多層級(jí)的TAD結(jié)構(gòu)，兩類(lèi)不同的TAD結(jié)構(gòu)在生物學(xué)功能上具有差異[12]。比較而言，多層級(jí)的TAD具有更活躍的表觀遺傳狀態(tài)和較高的基因表達(dá)水平[12, 13]。此外，多層級(jí)的TAD間常共享同一TAD邊界，這些邊界常表現(xiàn)出非對(duì)稱(chēng)性，較非共享邊界具有更活躍的表觀遺傳修飾和基因表達(dá)，且富集大量的啟動(dòng)子，這些TAD邊界在基因組的結(jié)構(gòu)維持及基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用[12, 13]。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，TAD在DNA損傷修復(fù)中具有重要調(diào)控作用，TAD內(nèi)染色質(zhì)環(huán)擠出能夠確保DNA損傷修復(fù)結(jié)構(gòu)的建立，并避免基因表達(dá)受到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響[5, 6]。那么輻射誘導(dǎo)DNA損傷時(shí)，TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的拓?fù)渥兓欠裨诩?xì)胞輻射響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用？本文基于前期已發(fā)表文獻(xiàn)中5Gy X射線照射后的淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及ATM缺陷的成纖維細(xì)胞的Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)，探索了不同細(xì)胞系，輻射處理后不同時(shí)間，TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，提出了輻射誘導(dǎo)TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)變化調(diào)控基因表達(dá)參與輻射響應(yīng)的模型，為理解染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)如何參與細(xì)胞輻射響應(yīng)提供了新視角。

1 材料與方法

1.1 Hi-C數(shù)據(jù)集

本研究使用的26個(gè)Hi-C數(shù)據(jù)來(lái)自于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE136899)，包括淋巴細(xì)胞(GM12878)、成纖維細(xì)胞(BJ和MRC5，其中BJ細(xì)胞包含兩個(gè)克隆：BJ1和BJ5ta)和ATM缺陷的成纖維細(xì)胞(ATM基因突變的BJ細(xì)胞，ATM抑制劑KU-55933處理的BJ細(xì)胞和ATM缺失病人的原代成纖維細(xì)胞GM02052)，5Gy X射線處理后30 min，24 h和5 d的Hi-C數(shù)據(jù)[5]。每個(gè)樣本的Hi-C數(shù)據(jù)來(lái)源于5×106個(gè)細(xì)胞的測(cè)序結(jié)果，每個(gè)細(xì)胞包含約100～200個(gè)DSB位點(diǎn)[5]。本研究中使用的Hi-C數(shù)據(jù)為Sanders等在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE136899)中提供的經(jīng)過(guò)質(zhì)控和歸一化處理后的Hi-C相互作用矩陣[5]。

1.2 拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域多層級(jí)結(jié)構(gòu)的識(shí)別

TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)OnTAD算法識(shí)別，該算法是一種優(yōu)化的巢式TAD結(jié)構(gòu)識(shí)別算法，可以從Hi-C數(shù)據(jù)識(shí)別多層級(jí)TAD結(jié)構(gòu)[12]。OnTAD通過(guò)兩步實(shí)現(xiàn)對(duì)TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的識(shí)別：首先通過(guò)自適應(yīng)局部最小化搜索算法，用WxW的菱形滑動(dòng)窗口掃描并識(shí)別候選TAD邊界；隨后被識(shí)別的候補(bǔ)TAD邊界以基于評(píng)分的遞歸動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法組裝成多層級(jí)的TAD結(jié)構(gòu)[12]。OnTAD方法將TAD分為5個(gè)層級(jí)，其中最外側(cè)的TAD為層級(jí)1，層級(jí)2為層級(jí)1直接嵌套的子TAD，以此類(lèi)推。以40 kb分辨率的Hi-C矩陣作為OnTAD算法的輸入，將最大的TAD尺度定為50個(gè)bin(識(shí)別的最大的TAD為2 Mb)，將最小的TAD尺度定為1個(gè)bin(識(shí)別的最小的TAD為40 kb)，將“penalty”參數(shù)設(shè)置為 0.1。為保證樣本間的可比性，對(duì)所有樣本的計(jì)算使用同樣的參數(shù)。同時(shí)，對(duì)TAD邊界進(jìn)行定義：根據(jù)某一邊界兩側(cè)TAD的數(shù)量，以TAD數(shù)量多的一側(cè)作為該邊界的層級(jí)，TAD邊界同樣分為5級(jí)。

1.3 拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域邊界層級(jí)的定義

通過(guò)OnTAD識(shí)別各樣本不同層級(jí)TAD，得到TAD兩端的位置信息，將TAD起點(diǎn)和終點(diǎn)的上下游60 kb定義為T(mén)AD邊界。對(duì)26個(gè)樣本進(jìn)行TAD邊界識(shí)別，將重復(fù)樣本的TAD邊界層級(jí)進(jìn)行整合，取兩重復(fù)樣本中TAD邊界層級(jí)數(shù)高的作為該樣本的TAD邊界層級(jí)。

1.4 拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域邊界的聚類(lèi)分析及可視化

在獲得TAD邊界信息后，將26個(gè)樣本的TAD邊界合并分析，采用ward層次聚類(lèi)方法對(duì)26個(gè)Hi-C數(shù)據(jù)中保守的TAD邊界進(jìn)行聚類(lèi)，并使用R包c(diǎn)orrplot對(duì)不同樣本TAD邊界間的相關(guān)性分析，并進(jìn)行可視化。

1.5 拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域邊界層級(jí)變化的顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)獨(dú)立樣本的兩比例Z檢驗(yàn)判斷淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及ATM缺失的淋巴細(xì)胞輻射后30 min、24 h的不同層級(jí)TAD邊界變化比例是否存在顯著差異。N.S.:P>0.05;*P<=0.05;**P<=0.01;***P<=0.001;****P<=0.0001。

1.6 基因的拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域嵌套層級(jí)分?jǐn)?shù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

TAD嵌套層級(jí)分?jǐn)?shù)(TAD hierarchical score，TH score)的計(jì)算由bedtools軟件的coverage功能實(shí)現(xiàn)，采用hg19基因注釋文件進(jìn)行注釋?zhuān)哂兄貜?fù)樣本的數(shù)據(jù)，取基因在2個(gè)重復(fù)樣本中TH分?jǐn)?shù)(score)的平均值，并對(duì)ΔTH score(實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組)>1.5的基因進(jìn)行篩選[14]。采用R包ggpubr中的非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，并計(jì)算配對(duì)樣本間的基因TAD層級(jí)分?jǐn)?shù)差異。

1.7 基因功能富集分析

通過(guò)R包enrichR對(duì)GM12878細(xì)胞輻射后30 min TH score變化較大的基因進(jìn)行功能富集分析[15]。

1.8 基因組位置注釋

基因組位置信息通過(guò)UCSC基因組瀏覽器(http://genome.ucsc.edu)注釋[16]。

2 結(jié)果

2.1 Hi-C數(shù)據(jù)的收集與分析

為了探究輻射后細(xì)胞TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及其在細(xì)胞輻射響應(yīng)中的作用，本研究選用了前期已發(fā)表的淋巴細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和ATM缺陷的成纖維細(xì)胞，經(jīng)5Gy X射線處理后30 min，24 h和5 d 的Hi-C數(shù)據(jù)(Fig.1A)。獲得26個(gè)樣本的Hi-C數(shù)據(jù)，對(duì)各樣本中的TAD層級(jí)、TAD邊界層級(jí)進(jìn)行識(shí)別并計(jì)算了基因的TAD層級(jí)嵌套分?jǐn)?shù)(Fig.1B)，從細(xì)胞系、ATM及輻射后的時(shí)間三個(gè)方面，對(duì)TAD邊界層級(jí)和基因的TAD層級(jí)嵌套分?jǐn)?shù)變化進(jìn)行分析，比較不同輻射敏感性的細(xì)胞，在輻射后不同時(shí)間TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，探索ATM缺失對(duì)輻射后細(xì)胞TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化的影響及TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化在細(xì)胞輻射響應(yīng)中的作用(Fig.1C)。

Fig.1 Scheme of analysis (A) 26 Hi-C data obtained from GEO database including irradiated lymphoblasts, fibroblasts and fibroblasts deficient in ATM with 5 Gy X-ray. (B) Identification of hierarchical TAD and TAD boundary and calculation of TH score. (C) Data comparison from three aspects: ① cell line，② ATM and ③ time after radiation

2.2 多層級(jí)拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域及邊界的識(shí)別

使用OnTAD算法對(duì)26個(gè)樣本中的多層級(jí)TAD進(jìn)行識(shí)別，并定義TAD邊界層級(jí)。結(jié)果顯示，TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)普遍存在于淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，以GM12878細(xì)胞系1號(hào)染色體的18.09 ～ 18.28 Mb區(qū)域?yàn)槔?，該區(qū)域?yàn)槎鄬蛹?jí)的TAD嵌套結(jié)構(gòu)，外部為大的1級(jí)TAD，內(nèi)部嵌套著多層級(jí)的TAD結(jié)構(gòu)，并包含有不同層級(jí)的TAD邊界(Fig.2A、2B)。對(duì)各樣本不同層級(jí)的TAD和TAD邊界數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，平均每個(gè)樣本識(shí)別出了 4 054(±206)個(gè) TAD 結(jié)構(gòu)和3 805(±149)個(gè) TAD 邊界，3層級(jí)及以上的TAD和TAD邊界數(shù)量較少(Fig.2B)。對(duì)26個(gè)樣本中的保守的TAD邊界進(jìn)行相關(guān)性分析并聚類(lèi)，可以區(qū)分淋巴細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和ATM缺陷的成纖維細(xì)胞(Fig.2C)，說(shuō)明TAD邊界層級(jí)具有一定細(xì)胞特異性。

Fig.2 Identification of the hierarchical TAD and TAD boudary (A) Multilevel TAD and TAD boundary of the subregion on chromosome 1 of GM12878 cell visualized by 40 kb-resolution Hi-C data. (B) Numbers of TAD and TAD boundary in 26 samples. (C) Hierarchical clustering of samples using the similarity of TAD boundary positions. Color bar shows the correlation coefficient between different samples

2.3 輻射誘導(dǎo)的拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域邊界層級(jí)變化

為了確定輻射對(duì)TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)5Gy X射線照射后30 min和24 h的淋巴細(xì)胞(GM12878細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞(BJ細(xì)胞)不同層級(jí)的TAD邊界與相應(yīng)對(duì)照組進(jìn)行比較。與未照射細(xì)胞相比，輻射后30 min和24 h，GM12878細(xì)胞和BJ細(xì)胞的各層級(jí)TAD邊界均發(fā)生了較大變化，其中發(fā)生變化的1層級(jí)和2層級(jí)TAD邊界有30% ～ 40%，發(fā)生變化的3層級(jí)及以上TAD邊界有40% ～ 50%。說(shuō)明高層級(jí)TAD邊界對(duì)輻射更敏感，輻射條件下細(xì)胞的低層級(jí)的TAD結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。此外，GM12878細(xì)胞與BJ細(xì)胞輻射后30 min和24 h的TAD邊界層級(jí)變化表現(xiàn)出了不同的模式，GM12878細(xì)胞輻射后24 h較輻射后30 min，隨著TAD邊界層級(jí)升高，未變化TAD邊界和獲得層級(jí)的TAD邊界比例增加，缺失層級(jí)的TAD邊界的比例減少，BJ細(xì)胞輻射后24 h較輻射后30 min，不同層級(jí)的未變化TAD邊界比例均下降，而層級(jí)增加的TAD邊界比例變化較小，缺失層級(jí)邊界的TAD邊界比例上升(Fig.3A)。GM12878細(xì)胞與BJ細(xì)胞輻射后變化模式的不同，可能與淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的輻射敏感性差異相關(guān)。為了觀察高層級(jí)TAD對(duì)輻射更敏感的規(guī)律是否在基因組范圍內(nèi)存在，對(duì)GM12878細(xì)胞5Gy X射線照射后24 h各染色體1層級(jí)TAD邊界和3層級(jí)TAD邊界變化情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)照射后GM12878細(xì)胞各染色體的低層級(jí)TAD邊界均表現(xiàn)出更高的保守性，說(shuō)明輻射誘導(dǎo)的TAD邊界層級(jí)變化規(guī)律在全基因組范圍內(nèi)存在(Fig.3B)。

Fig.3 Changes of the hierarchical TAD boundary (A) Proportion of the hierarchical TAD boundary changed/unchanged in GM12878 and BJ cells after (30 min and 24 h) exposure to 5 Gy X-ray compared with control. N.S.: P > 0.05;*: P <= 0.05;**: P <= 0.01;***: P <= 0.001;****: P <= 0.0001). (B) Proportion of level 1 and level 3 TAD boundary changed/unchanged in GM12878 after (24 h) exposure to 5 Gy X-ray compared with control

2.4 輻射誘導(dǎo)的基因拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域嵌套水平變化

前期研究表明，TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)密切相關(guān)[14]，為了探究輻射誘導(dǎo)的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化是否參與細(xì)胞輻射響應(yīng)，對(duì)各樣本中18 000多個(gè)基因的TAD層級(jí)嵌套分?jǐn)?shù)“TH score”進(jìn)行計(jì)算，并對(duì)各樣本中基因的TH score是否存在差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，輻射后30 min和24 h，GM12878細(xì)胞和BJ細(xì)胞的TH score均發(fā)生顯著變化，輻射敏感的淋巴細(xì)胞輻射后30 min基因的TH score變化較大，而輻射相對(duì)不敏感的成纖維細(xì)胞基因的TH score變化較小，說(shuō)明輻射后TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化與細(xì)胞輻射敏感性相關(guān)。輻射后5 d，BJ細(xì)胞的TH score與對(duì)照組無(wú)顯著差異，說(shuō)明BJ細(xì)胞完成輻射損傷修復(fù)后，基因的TAD層級(jí)恢復(fù)至初始水平(Fig.4A)。為了驗(yàn)證細(xì)胞輻射后基因的TAD層級(jí)嵌套水平變化是否參與細(xì)胞的輻射響應(yīng)，基于TH score變化較大的淋巴細(xì)胞輻射后30 min的Hi-C數(shù)據(jù)，篩選出TAD嵌套結(jié)構(gòu)變化較大的基因(Fig.4B)，進(jìn)行基因功能富集分析，發(fā)現(xiàn)TH score變化較大的基因富集了與淋巴細(xì)胞的功能紊亂及細(xì)胞輻射損傷修復(fù)相關(guān)的多種生物學(xué)功能，例如淋巴細(xì)胞黏附、B細(xì)胞激活、DNA雙鏈斷裂修復(fù)和細(xì)胞凋亡等，說(shuō)明輻射誘導(dǎo)的基因TAD嵌套水平改變會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，并參與細(xì)胞的輻射響應(yīng)(Fig.4C)。

2.5 毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變基因在輻射誘導(dǎo)的拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域?qū)蛹?jí)結(jié)構(gòu)變化中的作用

為了評(píng)估ATM在輻射誘導(dǎo)的TAD邊界層級(jí)變化中的作用，對(duì)X射線照射后24 h的BJ細(xì)胞與ATM缺陷的BJ細(xì)胞各層級(jí)TAD邊界變化進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ATM突變后，BJ細(xì)胞輻射后24 h的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化減弱，未變化TAD邊界變化比例顯著增加，說(shuō)明ATM在輻射誘導(dǎo)TAD邊界層級(jí)變化中具有重要作用(Fig.5A)。對(duì)ATM抑制和突變的BJ細(xì)胞5Gy X射線照射后24 h和對(duì)照組的TH score進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)正常BJ細(xì)胞輻射后5 d，基因的TH score恢復(fù)正常(Fig.4A)，但ATM缺失的基因TH score并未完全恢復(fù)(Fig.5B)，說(shuō)明ATM對(duì)輻射后的基因TAD層級(jí)嵌套水平的恢復(fù)具有重要作用。

Fig.4 Radiation-induced changes of TH score (A) The TH score of lymphoblasts and fibroblasts. Statistical significance between two independent samples was calculated by the wilcoxon test (N.S.: P > 0.05;**: P <= 0.01;***: P <= 0.001;****: P <= 0.0001). (B) TH score heatmap of GM12878 before (control) and after (30 min) exposure to 5 Gy X-ray (gene names are partially displayed). (C) Gene ontology analysis of genes whose TH scores were significantly changed (ΔTH > 1.5, bule: TH score increased, orange: TH score decreased in GM12878 cells after (30 min) exposure to 5Gy X-ray

Fig.5 Changes of the TAD hierarchy in ATM-deficient cells (A) Proportion of hierarchical TAD boundary changed/unchanged in BJ cells and ATM mutant BJ cells after exposure (24 h) to 5 Gy X-ray compared with control. (B) TH scores of ATM-deficient BJ cells. Statistical significance between two independent samples was calculated by the wilcoxon test (N.S.: P > 0.05;**: P <= 0.01;***: P <= 0.001;****: P <= 0.0001)

2.6 拓?fù)潢P(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域?qū)蛹?jí)結(jié)構(gòu)變化參與細(xì)胞輻射響應(yīng)模型

前期研究表明，TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表觀遺傳狀態(tài)及表達(dá)活性密切相關(guān)，高層級(jí)TAD結(jié)構(gòu)具有更活躍的表觀遺傳狀態(tài)，隨著TAD層級(jí)增加，GM12878細(xì)胞的基因表達(dá)密度明顯上升，且TAD內(nèi)部嵌套的基因表達(dá)活性比外層更加活躍[12]。輻射后淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的TAD邊界層級(jí)及基因TAD嵌套水平發(fā)生明顯改變，輻射后30 min淋巴細(xì)胞TH score變化較大的基因主要參與了細(xì)胞生物學(xué)功能變化及輻射響應(yīng)，輻射誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化可能通過(guò)改變基因的TAD嵌套水平調(diào)控基因表達(dá)參與細(xì)胞輻射響應(yīng)。輻射誘導(dǎo)TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化，及其參與細(xì)胞輻射響應(yīng)機(jī)制可總結(jié)為以下模型：首先細(xì)胞受到射線照射后，細(xì)胞的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，基因的TAD嵌套水平隨之變化(Fig.6A)；導(dǎo)致基因局部的染色質(zhì)相互作用改變，調(diào)控基因表達(dá)(Fig.6B)；基因表達(dá)變化一方面導(dǎo)致細(xì)胞的生物學(xué)功能紊亂，另一方面通過(guò)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程參與細(xì)胞的輻射響應(yīng)(Fig.6C)。

Fig.6 Models of radiation-induced TAD hierarchy change regulating cellular responses to radiation (A) Radiation-induced TAD hierarchy change. (B) Regulation of gene expression. (C) Radiation-induced cell dysfunction and cellular responses to radiation

3 討論

基因組三維結(jié)構(gòu)是DNA復(fù)制、基因表達(dá)調(diào)控、變異和進(jìn)化的基礎(chǔ)，闡明基因組功能是理解遺傳物質(zhì)如何決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵。TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)分析工具近年才開(kāi)發(fā)，目前對(duì)于輻射誘導(dǎo)TAD層級(jí)變化的機(jī)制及其在細(xì)胞輻射響應(yīng)中的作用尚未有深刻探討。本文使用OnTAD算法分析了成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和ATM缺陷的成纖維細(xì)胞5Gy X射線照射后30 min、24 h和5 d的TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)，總結(jié)了不同細(xì)胞系、輻射后不同時(shí)間、不同層級(jí)TAD及邊界的變化規(guī)律，并觀察了ATM缺失對(duì)TAD層級(jí)變化的影響，發(fā)現(xiàn)TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)變化是細(xì)胞輻射響應(yīng)的潛在機(jī)制，并提出了輻射誘導(dǎo)的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化參與細(xì)胞輻射響應(yīng)的模型，為理解輻射條件下，細(xì)胞如何通過(guò)TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化維持基因組三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提供了基礎(chǔ)，同時(shí)從TAD層級(jí)變化角度解釋了ATM誘導(dǎo)細(xì)胞輻射響應(yīng)的潛在機(jī)制。

前期研究表明，輻射后TAD邊界通過(guò)富集CTCF和黏連蛋白得到加強(qiáng)，以維持基因組三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[5, 6]。TAD可以調(diào)控DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵分子在輻射誘導(dǎo)的DNA斷裂位點(diǎn)的募集和擴(kuò)散，一方面促進(jìn)TAD內(nèi)部DNA損傷位點(diǎn)的快速修復(fù)，另一方面限制γH2AX在DNA損傷位點(diǎn)局部擴(kuò)散，以免影響其他未受損位點(diǎn)基因的表達(dá)[5, 6]。本文從一個(gè)新的角度——TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)出發(fā)，分析了輻射條件下TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)輻射對(duì)高層級(jí)TAD結(jié)構(gòu)影響更大，低層級(jí)TAD相對(duì)保守。輻射誘導(dǎo)的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞輻射響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，參與輻射后細(xì)胞的命運(yùn)決定。

本研究從TAD邊界層級(jí)和基因的TAD嵌套水平角度分析了輻射對(duì)TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。5Gy X射線照射后5 d，成纖維細(xì)胞的TAD邊界層級(jí)未完全恢復(fù)，而基因的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)恢復(fù)至對(duì)照水平，這可能是染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的高度動(dòng)態(tài)變化導(dǎo)致的。輻射誘導(dǎo)的染色質(zhì)的拓?fù)湫再|(zhì)改變，伴隨著TAD邊界的不斷變化，這種變化既包括TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的邊界層級(jí)丟失或獲得，也包含TAD邊界位置的動(dòng)態(tài)變化。成纖維細(xì)胞基因的TAD層級(jí)在輻射5 d后恢復(fù)至對(duì)照水平，說(shuō)明盡管輻射后TAD層級(jí)邊界發(fā)生了復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化，但在TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)的總體調(diào)控上，仍能保證基因的TAD層級(jí)恢復(fù)正常，保證細(xì)胞基因表達(dá)的穩(wěn)定性。此外，ATM缺失的成纖維細(xì)胞輻射后5 d，其基因嵌套水平與對(duì)照組仍存在明顯差異，說(shuō)明ATM作為輻射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵激酶，不僅可以參與TAD內(nèi)DNA損傷修復(fù)中心的形成，還能通過(guò)調(diào)控輻射誘導(dǎo)的TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)變化和恢復(fù)，參與細(xì)胞輻射響應(yīng)。輻射會(huì)導(dǎo)致TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，伴隨基因TAD的嵌套水平顯著變化，5Gy X射線照射后30 min，GM12878細(xì)胞發(fā)生TAD嵌套水平顯著變化的基因與細(xì)胞輻射損傷修復(fù)功能密切相關(guān)。我們的前期研究表明，TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)水平密切相關(guān)[14]，據(jù)此我們提出了輻射誘導(dǎo)TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化，及其參與細(xì)胞輻射響應(yīng)機(jī)制的模型：輻射誘導(dǎo)TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化介導(dǎo)基因表達(dá)改變，使細(xì)胞的生物學(xué)功能紊亂，并通過(guò)DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程參與細(xì)胞的輻射響應(yīng)。然而，Sanders等人提供的Hi-C數(shù)據(jù)缺少與之匹配的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，輻射誘導(dǎo)TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)變化與細(xì)胞輻射響應(yīng)基因表達(dá)之間的相關(guān)性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)可能是細(xì)胞輻射敏感性的決定因素之一。盡管TAD結(jié)構(gòu)在不同細(xì)胞和物種中高度保守，但不同細(xì)胞系的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)仍存在一定異質(zhì)性，例如本研究中的淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞中低層級(jí)TAD比例相較于淋巴細(xì)胞細(xì)胞高，而低層級(jí)的TAD結(jié)構(gòu)可能使成纖維細(xì)胞的基因組三維結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，輻射造成其TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化需要的能量更大，使其TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)在輻射條件下更加保守。由于Hi-C數(shù)據(jù)的測(cè)序結(jié)果來(lái)自于數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，所以分析得到的TAD多層級(jí)結(jié)構(gòu)通常是許多細(xì)胞TAD結(jié)構(gòu)疊加的結(jié)果[17]。細(xì)胞的TAD層級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的異質(zhì)性，即同一細(xì)胞系中存在不同TAD層級(jí)分布模式，基因組上的同一位置，部分細(xì)胞可能表現(xiàn)為高層級(jí)TAD結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞表現(xiàn)為低層級(jí)TAD結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞在輻射過(guò)程中受到的輻射損傷及響應(yīng)機(jī)制可能存在差異。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)逐漸成熟，目前已經(jīng)可以獲取單個(gè)細(xì)胞的染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，基因表達(dá)和表觀修飾的數(shù)據(jù)，單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析算法的開(kāi)發(fā)也為細(xì)胞輻射響應(yīng)異質(zhì)性機(jī)制研究提供了條件[18-21]。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的成熟和相關(guān)算法的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性及其對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響將得到更深刻的理解。