龍培艷， 張文萍， 鄭 菊， 付燕林， 高 霄，王正薇， 肖 雁*

(1)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550004；2)貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽(yáng) 550004)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多，胞體最大的膠質(zhì)細(xì)胞，可為神經(jīng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、支持和保護(hù)[1,2]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為分泌型細(xì)胞，在生理或病理狀態(tài)下均可分泌外泌體[3]。外泌體可參與調(diào)節(jié)包括炎癥、免疫應(yīng)答、腫瘤生長(zhǎng)、神經(jīng)退行性疾病和血管疾病等在內(nèi)的多種病理生理過(guò)程[4-6]。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約18～26個(gè)核苷酸，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯[7]。外泌體可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)活性miRNA改變受體細(xì)胞的生理功能，實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]。缺血性中風(fēng)后再灌注損傷是血管性癡呆的主要原因之一，腦組織對(duì)缺血缺氧較為敏感，及時(shí)的恢復(fù)血流和氧氣對(duì)于維持神經(jīng)元正常功能極為關(guān)鍵，但同時(shí)也會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷，腦缺血再灌注會(huì)引起炎癥、氧化應(yīng)激及線粒體自噬等病理生理反應(yīng)[9]。同時(shí)腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活躍度增加，缺氧可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體，并且所分泌的外泌體還可以保護(hù)由缺氧缺血引起的神經(jīng)元線粒體自噬及細(xì)胞凋亡[10,11]，但外泌體內(nèi)的miRNA在此過(guò)程中的作用尚未明確。因此，本研究應(yīng)用氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬腦內(nèi)缺血再灌注，對(duì)正常培養(yǎng)和OGD/R培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體進(jìn)行miRNA測(cè)序，并對(duì)測(cè)序得到的差異miRNA進(jìn)行后續(xù)的功能富集分析，可為后續(xù)研究星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基，無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰酶，雙抗(鏈霉素，青霉素)購(gòu)買(mǎi)于以色列BI公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自武漢塞維爾公司；脫脂奶粉和RIPA購(gòu)自北京 Solarbio 有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量(marker)購(gòu)自上海愛(ài)必信公司；PVDF 膜購(gòu)于美國(guó) Millipore公司；ALIX、TSG101兔單克隆抗體購(gòu)自于英國(guó)abcam公司；HSP60鼠單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹公司；兔二抗和鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；TruSeq Small RNA Sample Prep Kits 試劑盒購(gòu)于美國(guó)Illumina公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和qPCR試劑盒購(gòu)自上海吉瑪公司；miRNA的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1.2.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組 本文使用的細(xì)胞為課題組前期從SD乳鼠大腦皮質(zhì)提取，并且通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白質(zhì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫熒光染色鑒定為星形膠質(zhì)細(xì)胞[12]。將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為正常培養(yǎng)組和OGD/R培養(yǎng)組，正常組用89%DMEM/F12，10%無(wú)外泌體FBS和1%雙抗制備的完全培養(yǎng)基在37 ℃，5%CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清；OGD/R組當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)從培養(yǎng)箱中取出，用PBS洗2次，再用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基洗1次，換含1%雙抗的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基在1%O2，5%CO2，94%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 h，之后取出用PBS洗2次，換89%DMEM/F12，10%無(wú)外泌體FBS和1%雙抗配制的正常培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基上清。

1.2.2 無(wú)外泌體血清制備 胎牛血清用超速離心機(jī)進(jìn)行離心，4 ℃條件下140 000 g離心2 h，棄去離心管底部沉淀，得到的血清于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 外泌體提取

使用超速離心法提取外泌體：收集2個(gè)組的細(xì)胞培養(yǎng)基上清，首先1 200 g離心10 min去除細(xì)胞團(tuán)，2 000 g離心10 min去除細(xì)胞碎片，11 000 g離心30 min去除小的細(xì)胞碎片和細(xì)胞器，最后，140 000 g離心90 min后收集外泌體，所有離心均在4 ℃下進(jìn)行，離心結(jié)束后用PBS重懸外泌體用于鑒定和后續(xù)測(cè)序。

1.4 外泌體鑒定

將外泌體用PBS重懸后低溫送往上海華盈生物公司，進(jìn)行納米顆粒追蹤技術(shù)分析和透射電鏡鑒定其形態(tài)特征。使用免疫印跡法檢測(cè)外泌體的標(biāo)志性蛋白質(zhì)：使用BCA法測(cè)外泌體的濃度，加入上樣緩沖液(loading buffer)，沸水浴5 min使其變性，放4 ℃?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量為30 μg，30 mA恒流電泳2 h，200 mA恒流濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜完用TBST洗3次，每次10 min。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗3次，每次10 min。一抗HSP60(1∶1 000)、TSG101(1∶1 000)、ALIX(1∶2 000)4 ℃搖床孵育過(guò)夜?；厥找豢?，TBST洗3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h后，再用TBST洗3次，每次10 min。加ECL發(fā)光液，使用蛋白質(zhì)曝光儀曝光。

1.5 miRNA測(cè)序

小RNA測(cè)序文庫(kù)制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits試劑盒。文庫(kù)制備工作完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用Illumina Hiseq2000進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序讀長(zhǎng)為單端 1X50 bp。miRNA數(shù)據(jù)分析軟件為ACGT101-miR，分析流程如下：(1)去除3′接頭和垃圾序列：獲取有效數(shù)據(jù)(clean data)；(2)長(zhǎng)度篩選：保留堿基長(zhǎng)度在18～26 nt的序列；(3)各種RNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析：將剩余序列比對(duì)(不包含miRNA)mRNA、RFam和Repbase數(shù)據(jù)庫(kù)，并進(jìn)行過(guò)濾；(4)miRNA鑒定：獲取有效數(shù)據(jù)，并比對(duì)前體和基因組進(jìn)行miRNA鑒定；(5)miRNA差異性分析，(6)差異性miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析。

1.6 差異基因功能富集分析

1.6.1 GO分析 GO功能分析是針對(duì)差異miRNA靶基因進(jìn)行功能注釋和歸類。GO分析柱狀圖是在所有選定的miRNA靶基因中，將這些基因?qū)?yīng)的GO注釋按照分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process)和細(xì)胞組成(cellar component)分為3類，并且將每一類中的GO功能按照注釋到的靶基因個(gè)數(shù)從高到低排序，并進(jìn)行作圖，橫坐標(biāo)是對(duì)GO的分類，縱坐標(biāo)是靶基因所占的百分比。GO分析散點(diǎn)圖是采用ggplot2對(duì)GO富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示：Rich factor表示位于該GO的差異基因個(gè)數(shù)/位于該GO的總基因數(shù)，P值越小，GO富集程度越高。

1.6.2 KEGG分析 KEGG功能注釋通路顯著性富集，主要是確定差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA靶基因進(jìn)行途徑(pathway)分析，并用超幾何分布檢驗(yàn)的方法, 計(jì)算每個(gè)途徑條目中差異miRNA靶基因富集的顯著性。

1.7 qPCR驗(yàn)證

選擇2個(gè)上調(diào)的miRNA(rno-let-7a-5p , rno-miR-93-5p)和2個(gè)下調(diào)的miRNA(rno-miR-375-3p_R-1_1ss21GT ，mmu-mir-6240-p5_1ss15TG)，進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。以 U6snRNA 為內(nèi)參，計(jì)算方法采用2-△△CT，miRNA引物序列見(jiàn)Table 1。

Table 1 Primer sequences of miRNAs

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本間統(tǒng)計(jì)使用t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05時(shí)，表示其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

在透射電鏡下觀察到外泌體呈囊泡狀，具有明顯的膜性結(jié)構(gòu)，并且包膜結(jié)構(gòu)完整，其內(nèi)含有低電子密度小顆粒 (Fig.1A、B)。從兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中經(jīng)超速離心所得的沉淀物，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示，超速離心所得的沉淀均表達(dá)ALIX、HSP60、TSG101外泌體標(biāo)志性蛋白質(zhì)(Fig.1C)。納米顆粒追蹤技術(shù)(NTA)分析檢測(cè)到星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體大小為100.5±31.1 nm，占比為 96.8%(Fig1D)。

Fig.1 Identification of astrocyte-derived exosomes (A) Electron micrograph of astrocyte-derived exosomes of the control group; (B) Electron micrograph of astrocyte-derived exosomes of the OGD/R group; (C) Western blot detection showed that the exosome contained exosome-specific proteins tumor-susceptibility protein (TSG101), heat shock protein 60 (Hsp60), ALG-2-interacting protein X(ALIX); (D) NTA detected astrocyte exosomes with a size of 100.5±31.1 nm, accounting for 96.8%

2.2 差異miRNA表達(dá)

此次測(cè)序共檢測(cè)到292種miRNA，其中有157種miRNA是在兩個(gè)組中都存在，只存在于正常組中的有46種miRNA，只存在于OGD/R組中有89種miRNA(Fig.2)。OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體與正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體相比共有41個(gè)miRNA表達(dá)具有顯著差異性(P<0.05)，其中有20個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，21個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，差異miRNA具體信息查看Table 2。

Table 2 Differentially expressed miRNAs in the OGD/R group compared to the control group

Fig.2 The Venn diagram of differentially expressed miRNA Totally 292 miRNAs were detected in this sequence, showing the overlap of 157 miRNAs between both groups

2.3 差異miRNA火山圖

以∣log2(Fold change)∣>1 (即兩倍差異倍數(shù))且p<0.05為閾值做火山圖。紅色代表顯著上調(diào)差異表達(dá)miRNA共有14個(gè)，藍(lán)色代表顯著下調(diào)差異表達(dá)miRNA共有16個(gè)，灰色圓點(diǎn)代表非顯著差異表達(dá)miRNA。

2.4 差異miRNA靶基因 GO分析

由GO富集柱狀圖(Fig.4)顯示，差異miRNA相對(duì)應(yīng)的靶基因在生物過(guò)程中主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的調(diào)控、氧化還原過(guò)程及蛋白質(zhì)磷酸化等有關(guān)；在細(xì)胞組成上主要參與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等的組成；在分子功能上主要與蛋白質(zhì)結(jié)合和金屬離子結(jié)合等有關(guān)。

Fig.3 Volcano map of differentially expressed miRNAs in OGD/R group vs Control group Red represents 14 miRNAs that are significantly up-regulated, blue represents 16 miRNAs that are significantly down-regulated, and gray dots represent non-significantly differentially expressed miRNAs

Fig.4 Histogram of GO enrichment of the predicted target genes of the differentially expressed miRNAs The target genes are mainly related to signal transduction, regulation of transcription by RNA polymerase Ⅱ, Oxidation-reduction process and protein phosphorylation in biological processes. They are mainly involved in the composition of cell membrane, cytoplasm, and nucleus. They are mainly related to molecular functions including protein binding and metal ion binding and so on

GO富集散點(diǎn)圖(Fig.5)表明，差異表達(dá)基因主要與蛋白質(zhì)糖基化、脂質(zhì)代謝過(guò)程、磷酸化作用、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)吞體、細(xì)胞質(zhì)囊泡和細(xì)胞突起等有關(guān)。

Fig.5 Scatter plot of GO enrichment of the predicted target genes of the differentially expressed miRNAs Differentially expressed genes are mainly related to protein glycosylation, lipid metabolism process, phosphorylation, Golgi membrane and apparatus, endoplasmic reticulum, endosome, cytoplasmic vesicles and cell junction

2.5 差異miRNA KEGG分析

KEGG通路分析散點(diǎn)圖(Fig.6)顯示，差異miRNA靶基因主要與丁酸代謝、β-丙氨酸代謝、脂肪酸降解、線粒體自噬、p53信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等代謝途徑和信號(hào)通路有關(guān)。

Fig.6 Scatter diagram of KEGG analysis of the predicted target genes of the differentially expressed miRNAs Differential target genes are mainly related to butyrate metabolism, β-alanine metabolism, fatty acid degradation, mitophagy, p53 signaling, Toll-like receptor signaling and other metabolic and signaling pathways

2.6 qPCR驗(yàn)證

選取的rno-let-7a-5p、rno-miR-93-5p、rno-miR-375-3p_R-1_1ss21GT 、mmu-mir-6240-p5_1ss15TG在正常組和OGD/R組外泌體表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且升高或者降低趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致(Table3)。

Table 3 Expression of miRNA in control group and OGD/R group

3 討論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得了正常培養(yǎng)和OGD/R培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體的miRNA差異表達(dá)譜，與正常組相比，OGD/R組共有41個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)的有20個(gè)，下調(diào)的有21個(gè)。為探索顯著差異表達(dá)的基因參與的生物學(xué)環(huán)節(jié)，將差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。GO分析顯示，顯著差異表達(dá)的靶基因主要參與蛋白質(zhì)糖基化、脂質(zhì)代謝過(guò)程、磷酸化作用、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)吞體、細(xì)胞質(zhì)囊泡和細(xì)胞突起等生物學(xué)過(guò)程；KEGG通路分析顯示，顯著差異表達(dá)的miRNA靶基因在丁酸代謝、β-丙氨酸代謝、脂肪酸降解、線粒體自噬、p53信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等代謝途徑和信號(hào)通路顯著富集。由上述研究分析發(fā)現(xiàn)，OGD/R組和正常組的差異主要集中在高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)吞體，線粒體自噬等方面，這些差異表明，氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體可能參與高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)改變及線粒體自噬過(guò)程。

缺血再灌注會(huì)引起一系列復(fù)雜的病理過(guò)程，包括炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激、線粒體自噬等，這一系列病理過(guò)程可導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和凋亡[9]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，可分泌含有核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的外泌體，對(duì)缺血再灌注的神經(jīng)元功能產(chǎn)生一定的調(diào)控作用[13]。課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行OGD/R后，會(huì)引起神經(jīng)元氧化應(yīng)激、線粒體自噬和細(xì)胞凋亡增加[14,15]。高爾基體作為一個(gè)在生物合成、蛋白質(zhì)的分類和轉(zhuǎn)運(yùn)上發(fā)揮重要作用的細(xì)胞器，通過(guò)糖基化、蛋白質(zhì)水解等方式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工修飾，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦缺血再灌注后高爾基體可發(fā)生形態(tài)改變，參與轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)激信號(hào)，觸發(fā)神經(jīng)元凋亡[16,17]。本次研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體miRNA的靶基因在高爾基體、高爾基體膜及蛋白質(zhì)糖基化上富集，由此可知外泌體差異miRNA可能會(huì)通過(guò)影響高爾基體的形態(tài)和蛋白質(zhì)的修飾來(lái)調(diào)控神經(jīng)元凋亡。

線粒體是真核生物進(jìn)行能量代謝、細(xì)胞分化和凋亡的重要場(chǎng)所，線粒體自噬可消除功能失調(diào)或冗余的線粒體，從而微調(diào)線粒體數(shù)量，維持能量代謝穩(wěn)定，線粒體自噬也是缺血再灌注的一個(gè)主要病理過(guò)程[18]。有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體可抑制由缺血缺氧引起的線粒體自噬[11]，Hou J等人[19]發(fā)現(xiàn)，miR-106b-5p可以阻斷線粒體融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)，從而損害肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和能量供應(yīng)，有文獻(xiàn)證實(shí)，miR-151-5p和miR-320-3P都能調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路活性[20,21]，PI3K/AKT可調(diào)節(jié)下游mTOR對(duì)線粒體自噬產(chǎn)生一定的調(diào)控作用。以上miRNA在本次研究OGD/R組均發(fā)生了改變，由此可知，OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體可能是通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA調(diào)控線粒體自噬過(guò)程。內(nèi)吞體可參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、溶酶體和自噬小體的形成，進(jìn)一步參與到缺血再灌注引起的線粒體融合分裂、自噬和炎癥反應(yīng)等病理過(guò)程中[22]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅在OGD/R引起的氧化應(yīng)激發(fā)揮重要作用，其與線粒體組成的線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAM)在線粒體自噬也發(fā)揮著重要作用[23]，這些都與本次研究發(fā)現(xiàn)具有一致性。由此可知，OGD/R的星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA，可能主要是通過(guò)調(diào)控神經(jīng)元線粒體自噬和氧化應(yīng)激等病理過(guò)程從而對(duì)氧糖剝奪的神經(jīng)元產(chǎn)生調(diào)控作用。

本次研究在應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)正常組和OGD/R組星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源外泌體miRNA進(jìn)行測(cè)序可知，線粒體自噬可能是顯著差異表達(dá)miRNA參與的一條重要通路，且線粒體自噬通路在缺血再灌注的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮了重要作用，這為下一步研究星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體對(duì)神經(jīng)元的具體機(jī)制提供了一定的基礎(chǔ)。盡管本研究獲得了差異表達(dá)基因的一些信息，但仍然存在一定的局限性，本研究?jī)H限于基因水平，缺乏細(xì)胞水平及動(dòng)物模型中的驗(yàn)證，課題組將在后期完善相關(guān)研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證本次發(fā)現(xiàn)。