張 娜， 李 萌， 李 嬌， 孟 珊， 蔡春波， 楊 陽， 高鵬飛，郭曉紅， 曹果清， 李步高

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖系豬種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801)

circRNA富含微RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，可以充當(dāng)與miRNA結(jié)合的競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。第1個被揭示具有調(diào)控功能的circRNA為ciRS7，它含有470個可與miR-7的結(jié)合的位點(diǎn)，可通過競爭性結(jié)合miR-7來提高其靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮作用[16]。另外，circARF3可通過吸附miR-103調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體自噬，從而抑制脂肪炎癥[17]。郭行雅[18]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠circRNA-0046367競爭性結(jié)合miR-34a可消除其對PPARα的抑制，從而降低脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，減輕肝的脂肪變性。miR-34a還能靶向PDGFRα抑制其表達(dá)，從而抑制脂肪生成[19]。Circ11897通過吸附miR-27a和miR-27調(diào)節(jié)豬皮下脂肪組織中脂肪細(xì)胞的脂滴生成和脂質(zhì)代謝[20]。miR-125a可促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖，并且通過負(fù)調(diào)節(jié)STAT3抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化[21]。circRNA在脂肪代謝過程中具有重要的調(diào)控作用，但其對豬成脂分化的作用及機(jī)制還鮮有研究。

基于本課題組前期測序[22]，發(fā)現(xiàn)circIGF1R來源胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)基因的第2外顯子，屬于外顯子circRNA。本研究對豬circIGF1R進(jìn)行鑒定及分析，探明其表達(dá)規(guī)律，繪制circIGF1R相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并構(gòu)建circIGF1R過表達(dá)載體，在間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2中異位表達(dá)，研究其對脂肪細(xì)胞分化的作用，以期為探究circIGF1R在豬脂肪代謝中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品采集 以剛出生的大白豬仔豬為試驗(yàn)動物，分離肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞；采集90 d杜長大豬的心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、背部皮下脂肪等組織；采集1 d、90 d、180 d杜長大豬的皮下脂肪。

1.1.2 試劑 間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存；Trizol購自Invitrogen公司；TB Green? Premix Ex TaqTM和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司；Opti-MEM、FBS購自Gibco公司；Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher公司；DMEM/HIGH GLUCOSE、Phosphate Buffer Saline購自HyClone公司；油紅O(Oil Red O)購自Solarbio公司；RNase R酶購自Lucigen公司；核質(zhì)分離試劑盒PARISTM Kit購自Life Technologies公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop) 、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix和Duo-Lite Luciferase Assay System購自諾唯贊公司；4%多聚甲醛購自Solaibio公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素、地塞米松(DEX)、吲哚美辛購自Sigma公司。

1.1.3 儀器 核酸蛋白質(zhì)測定(ND-1000，美國)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500 Real Time，美國)、全功能微孔板檢測儀(SynerGyH1，美國)、細(xì)胞成像系統(tǒng)(EVOS FL Auto，美國)等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

剛出生的仔豬放血處死后，75%酒精清洗全身，取背最長肌放入75%酒精中清洗后放入含4%雙抗的PBS中備用。使用含1%雙抗PBS反復(fù)沖洗肌肉組織，并在沖洗過程中剪除肌肉中的血管與筋膜，將處理干凈的肌肉組織放入裝有少量PBS的小燒杯中，將肌肉盡量剪碎，再將組織糜與Ⅱ型膠原酶按照1∶2混合后裝入50 mL離心管中，至于恒溫震蕩儀中37 ℃，120 r/min震蕩消化90 min左右，消化完成后加入等量完全培養(yǎng)基終止消化，依次過100 μm、70 μm、40 μm過濾篩，每次過濾之后1 500 r/min離心10 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基對細(xì)胞混合物沉淀重懸清洗1次，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基后均勻鋪在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)的原代肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞傳代1～2次后可用于試驗(yàn)。

將C3H10T1/2鋪板后待細(xì)胞密度達(dá)70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用lipo3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染OE-circIGF1R及OE-NC，轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h ～ 48 h后檢測過表達(dá)效率。轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞密度達(dá)90%，更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化7 d后進(jìn)行qRT-PCR及油紅O染色。

1.3 RNA提取及qRT-PCR

細(xì)胞RNA的提取操作步驟參考Trizol試劑說明書，并使用核酸檢測儀測定RNA濃度，將RNA濃度歸一為1 000 ng/μL，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR Select Master Mix和ABI Prism 7900監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列等見Table 1。以18S rRNA為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

Table 1 Primer sequences

1.4 RNase R消化試驗(yàn)

將RNA分成均等的2份，RNase R酶處理組：RNA 4 μL、10×反應(yīng)緩沖液2 μL、RNase R 0.5 μL、無RNase水 13.5 μL；對照組：RNA 4 μL、無RNase水 16 μL，進(jìn)行RNase R(20 U/μL)消化抗性試驗(yàn)，37 ℃水浴消化30 min。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。

1.5 核質(zhì)定位

當(dāng)肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)RNA，提取步驟參考核質(zhì)分離試劑盒說明書，并使用核酸檢測儀測定RNA濃度，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板qRT-PCR。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

構(gòu)建circRNA及FABP4的野生型及突變型psiCHECK-2載體，待24孔板內(nèi)293 T細(xì)胞長至50%時(shí)轉(zhuǎn)染，分組為mimics+circIGF1R-Mut、mimics+ circIGF1R-WT、miR NC+circIGF1R-WT；mimics+FABP4-Mut、mimics+FABP4-WT、miR NC+FABP4-WT，每組做3個重復(fù)，轉(zhuǎn)染48 h，棄培養(yǎng)基，1×PBS清洗細(xì)胞2次，操作步驟參考Duo-Lite Luciferase Assay System試劑盒。

1.7 油紅O染色

待C3H10T1/2誘導(dǎo)分化7 d后移除培養(yǎng)基，1×PBS清洗細(xì)胞2次，操作步驟參考油紅O說明書，染色完成后使用倒置顯微鏡拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，利用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，使用Graphpad Prism 5.0作圖，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬circIGF1R鑒定及亞細(xì)胞定位

前期課題組進(jìn)行了1 d、90 d與180 d大白豬的背最長肌全轉(zhuǎn)錄物組測序，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)一條來源于IGF1R第二外顯子的環(huán)狀RNA，全長546 bp，將其命名為circIGF1R(Fig.1)。

Fig.1 Schematic diagram of circIGF1R ring formation circIGF1R is formed by back-splicing of the second exon of its parental gene. The chr1 represents chromosome 1. Splice junction is the end-to-end position of the circRNA

據(jù)PCR發(fā)現(xiàn)，聚合引物(convergent primers)在以gDNA和cDNA為模板時(shí)均能擴(kuò)增出單一條帶；發(fā)散引物(divergent primers)只在以cDNA為模板時(shí)擴(kuò)增出單一條帶，以gDNA為模板時(shí)未見條帶(Fig.2A)，表明circIGF1R是豬基因組的反向剪接產(chǎn)物。對發(fā)散引物產(chǎn)物菌液進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，確實(shí)存在反向剪接位點(diǎn)(Fig.2B)。RNase R酶處理結(jié)果顯示，RNase R酶消化后，circIGF1R的表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，而IGF1R和18S rRNA的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)(Fig.2C)。由此證明，circIGF1R是來源于IGF1R基因的第2外顯子的外顯子circRNA。核質(zhì)分離結(jié)果顯示，circIGF1R 61%位于細(xì)胞質(zhì)中(Fig.2D)。

Fig.2 Identification and subcellular localization of circIGF1 (A) circIGF1R agarose gel electrophoresis. (B) Sanger sequencing to verify the circIGF1R splicing site. (C) RNase R digestion tests to examine circIGF1R and linear genes. (D) circIGF1R subcellular location. The values are presented as the means ± SEM (n=3),* represents significant difference (P<0.05),** represents extremely significant difference (P<0.01), the same as below.??represents divergent primers, ?? represents convergent primers

上述結(jié)果證明，circIGF1R是由胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R)第二外顯子形成的circRNA。

2.2 豬circIGF1R表達(dá)分析

組織表達(dá)分析顯示，circIGF1R在心血管組織中表達(dá)量最高，其次是背部皮下脂肪與背最長肌等(Fig.3A)。circIGF1R在不同發(fā)育階段脂肪組織中差異表達(dá)，其表達(dá)量隨著日齡增加呈上升趨勢(Fig.3B)。circIGF1R在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其表達(dá)量在誘導(dǎo)分化第5 d最高(Fig.3C)。

Fig.3 Expression analysis of circIGF1R The RNA of heart, liver, spleen, lung, kidney, skeletal muscle and subcutaneous fat of three Duroc-landrace-yorkshire (DLY) pigs were extracted for the following analysis. The subcutaneous fat RNA of three DLY pigs at 1 day, 90 days, and 180 days were extracted for expression profiles at different developmental stages. Porcine intramuscular preadipocyte cells were harvested for the following analysis at 0, 1, 3, 5 and 7 days at differentiation. (A) qRT-PCR analysis showing the expression of circIGF1R in various tissues. (B) qRT-PCR analysis showing the expression of circIGF1R in different developmental stages of pigs. (C) qRT-PCR analysis showing the expression of circIGF1R in different stages of intramuscular preadipocyte differentiation. The values are presented as the means ± SEM (n=3). Different letters indicate significant differences (P<0.05). 18S rRNA was used as an internal control

上述結(jié)果表明，circIGF1R在豬的各個組織中均有表達(dá)，且其表達(dá)量在脂肪組織中隨日齡增加呈上升趨勢。

2.3 豬circIGF1R功能預(yù)測

通過RNAhybird軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，circIGF1R可靶向結(jié)合多個miRNA：ssc-miR-15a、ssc-miR-16、ssc-miR-133a-5p、ssc-miR-214-3p、ssc-miR-885-3p等，miRDB、Targetscan、miRWalk在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，這些miRNA存在多個潛在靶基因，利用Cytoscape構(gòu)建circIGF1R-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Fig.4)。

Fig.4 CircIGF1R-miRNA-mRNA regulatory network The blue circle represents circRNA. The yellow circle represents miRNA. The green circle represents the target gene. The pink circle indicates the selected target gene

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對ssc-miR-133a-5p靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。GO分析發(fā)現(xiàn)，circIGF1R的靶標(biāo)基因的作用主要有轉(zhuǎn)錄(transcription)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)、核(nucleus)等(Fig.5A)。KEGG通路富集分析表明，circIGF1R的靶基因主要富集在胰島素抵抗(insulin resistance)、AMPK信號通路(AMPK signaling pathway)、嗎啡成癮(morphine addiction)cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)(Fig.5B)。

Fig.5 Enrichment analysis of GO (A) and KEGG (B) of ssc-miR-133a-5p target genes The horizontal axis represents the enrichment factor, and the vertical axis represents the path. Different colors represent different adjusted p-values, from blue to red, indicating that the adjusted p-value is increasing from large to small, and the degree of enrichment is becoming more and more significant. The size of the dot represents the number of genes enriched in this pathway

RNAhybird預(yù)測發(fā)現(xiàn)，circIGF1R可與ssc-miR-133a-5p種子序列結(jié)合(Fig.6A)，F(xiàn)ABP4可與ssc-miR-133a-5種子序列結(jié)合，是ssc-miR-133a-5p潛在的靶基因(Fig.6B)。

Fig.6 Binding site prediction (A) RNAhybird predicts the binding site of circIG1R and ssc-miR-133a-5p (B) the binding site of ssc-miR-133a-5p and the target gene FABP4

以上，基于基因表達(dá)相關(guān)性和預(yù)測的靶標(biāo)關(guān)系，繪制了GO和KEGG富集分析、構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò)及預(yù)測了circIGF1R-ssc-miR-133a-5p-FABP4之間的靶向序列。

2.4 ssc-miR-133a-5p及FABP4表達(dá)分析

組織表達(dá)分析顯示，ssc-miR-133a-5p在肝中表達(dá)量最高，其次是心血管、腎等組織(Fig.7A)；ssc-miR-133a-5p在不同發(fā)育階段脂肪組織中差異表達(dá)，其表達(dá)量隨著日齡增加呈下降趨勢(Fig.7B)；在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其表達(dá)量在誘導(dǎo)分化第3 d最低(Fig.7C)，其表達(dá)趨勢與circIGF1R相反。

Fig.7 Expression analysis of ssc-miR-133a-5p The RNA of heart, liver, spleen, lung, kidney, skeletal muscle and subcutaneous fat of three Duroc-landrace-yorkshire (DLY) pigs was extracted for the following analysis. The subcutaneous fat RNA of three DLY pigs at 1 days, 90 days, and 180 days was extracted for expression profiles at different developmental stages. Porcine intramuscular preadipocyte cells were harvested for the following analysis at 0, 1, 3, 5 and 7 days of differentiation. (A) qRT-PCR analysis showing the expression of ssc-miR-133a-5p in various organizations. (B) qRT-PCR analysis showing the expression of ssc-miR-133a-5p in different developmental stages of pigs. (C) qRT-PCR analysis showing the expression of ssc-miR-133a-5p in different stages of intramuscular preadipocyte differentiation. The values are presented as the means ± SEM (n=3). Different letters indicate significant differences (P<0.05). 18S rRNA was used as an internal control

FABP4在皮下脂肪中表達(dá)量極顯著高于其他組織(Fig.8A)；FABP4表達(dá)量隨著日齡增加在脂肪組織中升高(Fig.8B)；在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同時(shí)期從第3 d開始極顯著升高(Fig.8C)，其表達(dá)趨勢與circIGF1R相似。

Fig.8 Expression analysis of FABP4 The RNA of heart, liver, spleen, lung, kidney, skeletal muscle and subcutaneous fat of three Duroc-landrace-yorkshire (DLY) pigs was extracted for the following analysis. The subcutaneous fat RNA of three DLY pigs at 1 days, 90 days, and 180 days were extracted for expression profiles at different developmental stages. Porcine intramuscular preadipocyte cells were harvested for the following analysis at 0, 1, 3, 5 and 7 days of differentiation. (A) qRT-PCR analysis of expression of FABP4 in various tissues. (B) qRT-PCR analysis of expression of FABP4 in different developmental stages of pigs. (C) qRT-PCR analysis showing the expression of FABP4 in different stages of intramuscular preadipocyte differentiation. The values are presented as the means ± SEM (n=3). Different letters indicate significant differences (P<0.05). 18S rRNA was used as an internal control

過表達(dá)circIGF1R后，檢測到ssc-miR-133a-5p表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)(Fig.9A)，F(xiàn)ABP4表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)(Fig.9B)。

Fig.9 Expression of ssc-miR-133a-5p and FABP4 after overexpression of circIGF1R (A) Expression of ssc-miR-133a-5p after overexpression of circIGF1R. (B) Expression of FABP4 after overexpression of circIGF1R. The values are presented as the means ± SEM (n=3). 18S rRNA was used as an internal control.**P<0.01

以上結(jié)果表明，ssc-miR-133a-5p和FABP4在豬的各個組織中均有表達(dá)，且兩者表達(dá)量在脂肪組織中趨勢相反。其中，ssc-miR-133a-5p與circIGF1R表達(dá)量負(fù)相關(guān)，F(xiàn)ABP4與circIGF1R表達(dá)量正相關(guān)，兩者與circIGF1R的表達(dá)量趨勢關(guān)系符合ceRNA假說。

2.5 雙熒光素酶報(bào)告檢測驗(yàn)證circIGF1R及FABP4與ssc-miR-133a-5p結(jié)合

根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告檢測結(jié)果，mimics+circIGF1R-WT組的熒光值顯著低于mimics+circIGF1R-Mut組及miR NC+circIGF1R-WT組，可知circIGF1R與ssc-miR-133a-5p可以結(jié)合(Fig.10A)。mimics+FABP4-WT組的熒光值顯著低于mimics+FABP4-Mut組及miR NC+FABP4-WT組，可知FABP4與ssc-miR-133a-5p可以結(jié)合(Fig.10B)。上述結(jié)果表明，circIGF1R-ssc-miR-133a-5p-FABP4的ceRNA關(guān)系成立。

Fig.10 Dual luciferase report tests (A) Analysis results of circIGF1R and ssc-miR-133a-5p dual luciferase reporter enzymes. (B) Analysis results of FABP4 and ssc-miR-133a-5p dual luciferase reporter enzymes. The values are presented as the means ± SEM (n=3).*P<0.05

2.6 過表達(dá)circIGF1R促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化

構(gòu)建circIGF1R過表達(dá)載體，在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(C3H10T1/2)中異位表達(dá)，轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)分化7 d后，進(jìn)行qRT-PCR及油紅O染色。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circIGF1R后，關(guān)鍵成脂調(diào)控因子CEBPα、CEBPβ、FABP4和PPARγ極顯著升高(P<0.01)(Fig.11A，B)；油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circIGF1R后脂滴沉積明顯增多(Fig.11C)。上述結(jié)果表明，過表達(dá)circIGF1R促進(jìn)C3H10T1/2成脂分化。

Fig.11 Overexpression of circIGF1R qRT-PCR and oil red O staining (A) The expression level of circIGF1R, detected by qRT-PCR, in C3H10T1/2 cells transfected with OE-NC and OE-circIGF1R. (B) The expression of key genes of adipogenic differentiation after transfecting with OE-NC and OE-circIGF1R plasmids. (C) The results of Oil red O staining after transfecting the OE-NC and OE-circIGF1R plasmids in C3H10T1/2 cells. Scale bar is 400 μm. The values are presented as the means ± SEM (n=3). 18S rRNA was used as an internal control.**P<0.01

3 討論

隨著生活水平的不斷提高，人們對豬肉品質(zhì)要求越來越高。肌內(nèi)脂肪含量是影響豬肉品質(zhì)的重要因素之一，是決定肉質(zhì)嫩度和風(fēng)味等的重要指標(biāo)[23]。大量研究報(bào)道，circRNA在調(diào)控哺乳動物脂肪代謝方面發(fā)揮重要作用[12, 14, 24]，但其在豬方面研究仍處于初級階段。2019年，Liu等[25]對二花臉豬背最長肌內(nèi)脂肪、背皮下脂肪、腹膜脂肪和腸系膜脂肪組織進(jìn)行測序，共鑒定出13 746個circRNA，篩選出了大量與脂質(zhì)代謝有關(guān)的circRNA。目前，由于測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)[20, 26]，但關(guān)于circRNA的功能研究仍比較匱乏，尤其是其對豬脂肪代謝的影響。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)可通過與胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor，IGFR)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂類代謝和影響脂肪組織發(fā)育[27]。在胰島素樣生長因子家族成員中，胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)能夠結(jié)合胰島素樣生長因子(IGF1和IGF2)配體，并通過自身磷酸化，激活PI3K和MAPK信號通路，從而控制細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[28]。在禽類的研究中發(fā)現(xiàn)，IGF1R基因與控制禽類體重及骨骼生長發(fā)育的主要基因緊密連鎖，說明IGF1R可能參與調(diào)控禽類生長發(fā)育[29]。在對豬的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-455-5p可通過靶向IGF1R抑制豬前體脂肪細(xì)胞的增殖分化[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，circIGF1R是來源于IGF1R第二外顯子的circRNA。由此推測，circIGF1R可能參與調(diào)控豬前體脂肪細(xì)胞的成脂分化。

有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-133a可抑制Prdm16表達(dá)進(jìn)而阻止白色脂肪細(xì)胞褐變[31]。另外，Zhang等證明，上調(diào)miR-133a會誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生和C2C12成肌細(xì)胞分化[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，circIGF1R與ssc-miR-133a-5p表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果進(jìn)一步證明，circIGF1R可與ssc-miR-133a-5p結(jié)合。由此推測，circIGF1R可作為ssc-miR-133a-5p海綿，參與調(diào)控豬成脂分化。FABP4在脂肪細(xì)胞中分化依賴性表達(dá)，是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞生物功能的重要基因。FABP4正調(diào)控脂肪酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以直接靶向并將脂肪酸代謝產(chǎn)物傳遞到脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中[33]。有研究表明，小鼠給予高脂飲食后，敲除FABP4基因小鼠體重增加，血漿游離脂肪酸的濃度升高，膽固醇和甘油三酯的水平降低，顯示FABP4基因缺失的肥胖小鼠脂肪細(xì)胞的生理功能和游離脂肪酸代謝發(fā)生改變[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4是ssc-miR-133a-5p的一個靶基因，由此說明circIGF1R可能通過與FABP4競爭性結(jié)合ssc-miR-133a-5p參與調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪代謝。異位表達(dá)circIGF1R證明，circIGF1R會促進(jìn)C3H10T1/2的成脂分化，該結(jié)果與上述結(jié)果一致，更進(jìn)一步說明circIGF1R可參與調(diào)控成脂分化。本研究成功鑒定了豬的一個新circRNA-circIGFIR，并且初步證明其可通過ceRNA機(jī)制調(diào)控成脂分化。為進(jìn)一步研究circIGF1R調(diào)控豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。