陳 銳， 邵長鳳， 屈紅林， 陳伊琳， 陳嘉勤*

(1)湖南師范大學體育學院 體適能與運動康復湖南省重點實驗室， 長沙 410012；2)宜春學院體育學院理論教研室 江西， 宜春 336000)

長時間大量飲酒是影響酒精性肝損傷疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素，可造成酒精性肝炎、酒精性脂肪肝、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化和肝細胞癌等肝組織不同病理改變，在臨床最嚴重的表現(xiàn)形式是引起肝功能衰竭甚至死亡[1 , 2]。研究發(fā)現(xiàn)，酒精代謝過程中會產(chǎn)生過量自由基參與脂質(zhì)過氧化代謝，肝細胞抗氧化系統(tǒng)失衡，同時腸道菌群失調(diào)和腸道通透性增加等，誘導大量促炎癥因子堆積，造成肝細胞炎性損傷[3,4]。深入了解酒精性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展機制，尋找新的干預手段對酒精性肝損傷患者具有重要意義。

研究顯示，在生物體或細胞內(nèi)復雜多樣的信號通路中，氣體信號分子以傳播速度快、連續(xù)作用等特點成為研究焦點[5,6]。除NO和CO氣體信號分子外，作為哺乳動物體內(nèi)第3種新型內(nèi)源性氣體小分子，H2S具有不依賴相應質(zhì)膜受體，可自由滲透胞膜內(nèi)發(fā)揮生物學效應，調(diào)控多種生理及病理過程[7]。生理狀態(tài)下，肝在胱硫醚γ-裂解酶( cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶( cystathionine β-synthase，CBS)催化下可產(chǎn)生內(nèi)源性氣體分子H2S，參與調(diào)節(jié)機體氧化應激、炎性反應、脂代謝、細胞損傷等生理和病理過程，在線粒體中以β-巰基丙酮酸為底物催化生成H2S，可抑制炎癥介質(zhì)釋放，降低炎癥反應。同時，能明顯降低肝的脂質(zhì)蓄積和細胞損傷[8,9]。

目前，有氧運動康復成為改善慢性疾病的主要干預方式之一，主要優(yōu)勢在于易實施、技術(shù)簡單易接受，且低經(jīng)濟消費。以往的研究表明，形成規(guī)律運動習慣且達到相應運動強度，對機體健康可產(chǎn)生良好促進效應，可有效防止脂肪堆積和提高免疫能力等，對多類慢性疾病的預防、康復治療具有顯著效果[10]。而有氧運動是否能通過H2S介導炎性通路改善酒精性肝損傷的研究較少。本研究旨在構(gòu)建小鼠酒精性脂肪肝模型，通過有氧運動、H2S供體NaHS及H2S生成抑制劑PAG施加干預，探討有氧運動對酒精性肝損傷的影響及其機制，為運動干預在該類疾病的臨床康復應用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型構(gòu)建與分組

實驗對象為雄性昆明種小鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物中心提供(動物合格證號：43004700013147)，體質(zhì)量為37～41 g，購后于湖南師范大學體育學院體適能與運動康復省重點實驗室進行適應性飼養(yǎng)。7 d后，隨機分成酒精性脂肪肝病組(alcoholic fatty liver disease, AFLD)[模型組(M)、有氧運動組(E)、有氧運動+NaHS組(EN)、有氧運動+PAG組(EP)]，空白組(K)，每組10只。AFLD組建模第1周，采用含50%乙醇的谷酒王0.1 mL/10 g灌胃，第2周將酒精濃度提升至0.2 mL/10 g ?？瞻捉M(K)灌服等體積生理鹽水，持續(xù)7周。每籠5只，自由進食、飲水。

1.2 運動方案與給藥

酒精性脂肪肝模型構(gòu)建后觀察小鼠生活行為及運動能力，在進行正式運動干預前進行1周梯度適應訓練。目的在于提高小鼠運動適應能力，適應訓練方案：整體分3階段。第1階段采用6 m/min×25 min，為期2 d；第2階段采用8 m/min×40 min，調(diào)整跑臺坡度至5°，為期2 d；第3階段采用10 m/min×60 min，坡度調(diào)至8°，為期3 d。休息1 d后，保持第3階段訓練方式進行7周正式訓練。于每個訓練日16點進行，每周訓練6 d，休息1 d。有氧運動+NaHS組、有氧運動+PAG組，除運動干預外，根據(jù)小鼠與人體體表面積比每天給予腹腔注射0.2 mL(濃度為50 μmol/kg) NaHS溶液、0.2 mL(濃度為40 mg/kg) PAG溶液干預。

1.3 一般行為學觀察

運動干預期間觀察小鼠生活情況，每隔2周進行稱重記錄，記錄飲食、活動、毛色、肝重及肝體比等情況。

1.4 組織采集

取材前小鼠食物剝奪12 h，腹腔注射 1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉劑，待產(chǎn)生效應后，翻轉(zhuǎn)小鼠，若無翻正反射，剪去眼球周邊毛發(fā)，采用取眼球法收集血液，2 500 r/min×10 min，收集上層血清，超低溫保存，用于肝功能、H2S等相關(guān)指標檢測。手術(shù)刀切取10 mm3肝右葉組織，10%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH7.4)固定，進行病理組織結(jié)構(gòu)觀察及免疫組織化學染色。另取部分肝右葉組織進行H2S含量測定、相關(guān)蛋白質(zhì)檢測、mRNA提取及Illumina高通量測序。

1.5 指標檢測及方法

去蛋白質(zhì)法檢測血漿H2S含量，比色法測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性。取肝組織100 mg，加入液氮進行碾磨，吸入等體積RIPA裂解液勻漿，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用比色法測定肝組織谷胱甘肽(glutathione, GSH)、蛋白質(zhì)羰基化程度(蛋白質(zhì)氧化損傷程度指標)，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，化學法檢測胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)活性。

1.6 病理學觀察

取備存肝右葉組織，石蠟包埋，切片厚度4 μm，根據(jù)肝組織蘇木精-伊紅染色法步驟操作，觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)。

1.7 肝組織免疫組化染色及蛋白質(zhì)檢測

另取部分肝右葉切片，置于65 ℃烤箱脫蠟、復水和抗原修復。SABC法檢測酒精性脂肪肝小鼠肝組織中TLR4、NF-κB和IL-1β表達情況，蘇木素復染、梯度酒精脫水、透明和封片。Simple PCI高性能專業(yè)圖像分析軟件計算各因子陽性表達面積。取備存的肝組織勻漿上清液，采用Bradford法測定TLR4、NF-κB和IL-1β蛋白含量。

1.8 qRT-PCR及高通量測序

1.8.1 肝組織總RNA提取 取20 mg新鮮肝右葉組織。加液氮后碾磨，與1 mL trizol溶液充分混勻，待其室溫反應10 min，與0.2 mL氯仿溶液混合并震蕩，離心25 min，離心機轉(zhuǎn)速設(shè)置12 000 r/min，溫度設(shè)置4 ℃。去沉淀后，與等體積異丙醇溶液充分混勻，靜置反應15 min，高速離心25 min，去除上清液，試管內(nèi)加適量無水乙醇調(diào)配的75%酒精(DEPC處理水稀釋)，12 000 r/min離心15 min，反復洗滌3次后保留乳白色沉淀，與40 μL DEPC水混合，輕輕搖晃溶解沉淀，-80 ℃超低溫備存。

1.8.2 qRT-PCR 去除基因組DNA反應及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于TaKaRa公司，根據(jù)試劑盒操作說明進行。設(shè)置總RNA反轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，10 ℃ 5 min。qRT-PCR：選用儀器ABI 7900HT，試劑盒SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)，根據(jù)試劑盒操作說明進行。設(shè)置兩步法PCR反應擴增數(shù)據(jù)。Stage1：預變性溫度94 ℃ ，反應30 s，Stage 2：PCR反應溫度94 ℃ ，時間為3 s；60 ℃ ，時間為30 s，40循環(huán)數(shù)。檢測Toll樣受體4(toll-like receptors 4, TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)、白細胞介素-1β(IL-1β)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE) 的表達。根據(jù)GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中CSE、TLR4、NF-κB、IL-1βcDNA序列，其引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設(shè)計合成，因子mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。

1.8.3 高通量測序 提取E、M、EN、EP組樣本肝組織總RNA并進行純度檢測，經(jīng)富集、mRNA解鏈、cDNA合成等步驟形成cDNA二鏈。根據(jù)試劑盒操作說明進行操作，純化、洗脫、修復、擴增和測序。通過DEGseq基因表達開展各組小鼠間結(jié)果差異性對比，以∣log2 Ratio∣≥1與q<0.05取表達具有差異性基因。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 酒精性肝損傷構(gòu)建

隨酒精毒性積累，肝損傷程度加深，結(jié)果如Table 2所示。相比K組(2.41±0.09, 4.06±0.15)，AFLD組肝脂肪系數(shù)(3.46±0.07)及臟器系數(shù)(5.81±0.11)上升，血清肝功能指標數(shù)值上升，GSH含量下降(1.97±0.19)(P<0.01)，結(jié)果見Fig.1所示。肝細胞體積增大，肝索紊亂，脂質(zhì)空泡及炎性浸潤明顯，胞核呈現(xiàn)畸形或偏移，表明長期的酒精刺激已促使構(gòu)模小鼠肝功能損傷。

Table 1 PCR primer sequences

Table 2 Results of related biochemical indicators and coefficients of mice in each

Fig.1 Comparison of HE staining of liver tissue of mice in K group and AFLD group The AFLD group was given 50% ethanol 0.1 mL/10 g and 0.2 mL/10 g by gavage for one week, respectively, and the alcohol concentration was maintained for 7 weeks in the second week. The changes in the liver tissue structure of the mice in each group were observed. Red and black arrows indicate nuclear necrosis and lipid droplets, respectively

2.2 一般情況觀察

如Table 3所示，相比K組，各組小鼠肝組織脂重、脂肪系數(shù)及臟器系數(shù)上升(P<0.01或P<0.05)，體質(zhì)量無顯著變化(P>0.05)，表明酒精性脂肪肝小鼠肝組織脂肪重量上升。相比M組，E組、EN組脂肪系數(shù)和臟器系數(shù)下降(P<0.01)，相比E組，EN組脂肪系數(shù)和臟器系數(shù)下降，EP組無顯著變化，表明有氧運動及給予硫化氫供體NaHS可降低酒精性脂肪肝水平。

Table 3 Fat weight, wet liver weight and correlation coefficient results of mice in each group

2.3 血液及肝組織指標檢測

結(jié)果如Table 4所示。相比M組，E、EN、EP組AST、ALT、MDA含量下降、蛋白質(zhì)羰基化程度降低(P<0.01或P<0.05)，GSH和CSE含量增加(P<0.01或P<0.05)；相比E組，EP組AST、ALT、MDA、蛋白質(zhì)羰基化程度上升，GSH和CSE含量下降。且EN組AST、ALT、MDA、蛋白質(zhì)羰基化程度低于EP組，CSE含量上升，表明有氧運動可降低酒精性脂肪肝致肝功能損傷，增強硫化氫合成的關(guān)鍵酶CSE含量，且聯(lián)合硫化氫供體NaHS干預效果更佳。

Table 4 Test results of liver function and related indexes of mice in each group

2.4 不同干預方式對酒精性肝損傷小鼠肝及外周血中H2S含量的影響

結(jié)果如Table 5所示。相比K組，M組外周血與肝組織H2S含量上升；相比M組，E組、EN組、EP組外周血與肝組織H2S含量增加(P<0.01或P<0.05)；相比E組，EN組外周血與肝組織H2S含量上升，EP組含量下降(P<0.01)，表明有氧運動聯(lián)合硫化氫供體NaHS可增加小鼠肝及外周血中H2S含量。

Table 5 The H2S contents in plasma and liver tissue of each group of mice

2.5 肝組織形態(tài)學觀察

結(jié)果如Fig.2顯示。與K組比較，M組肝索結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)纖維化灶，大量炎性細胞浸潤與脂滴空洞，胞核呈畸形擴散、核壞死或核空泡。與M組相比，E、EN、EP組纖維化癥狀與炎癥浸潤減輕，存少量小泡樣脂滴，壞死面積降低；相比E組，注射NaHS組改善效果更佳，注射PAG抑制劑組可加重肝的病理改變，表明有氧運動可降低酒精性脂肪肝小鼠肝組織脂滴的形成，降低炎性反應，且聯(lián)合硫化氫供體NaHS干預效果最佳。

Fig.2 Comparison of HE staining results of different groups of mice After 7 weeks of aerobic exercise or combined intraperitoneal injection of sodium hydrogen sulfide enhancer (50 μmol/kg, 0.2 mL) and PAG inhibitor (40 mg/kg, 0.2 mL), the changes in liver tissue structure of mice in different groups were observed; Red, yellow and black arrows indicate vacuoles, nuclear necrosis and lipid droplets, respectively

2.6 免疫組織化學染色觀察與分析

研究結(jié)果見 Fig.3與Table 6所示。M組TLR4、IL-1β、NF-κB因子陽性表達最高，與M組比較，E、EN、EP組各因子陽性表達減少(P<0.01或P<0.05)，與E組比較，EN組各因子陽性表達減少(P<0.01)，EP組表達上升(P<0.05)，表明有氧運動干預下可降低酒精性脂肪肝小鼠肝組織TLR4/NF-κB通路中相關(guān)炎性因子的蛋白質(zhì)含量，且聯(lián)合NaHS干預效果更佳，而硫化氫生成抑制劑PAG的干預可升高相關(guān)炎性因子的含量。

Fig.3 The results of immunochemical staining of liver tissue in different groups After 7 weeks of different intervention methods, the expression levels of related proteins in the liver tissue of mice in each group were observed by immunohistochemical staining. Values are the mean ± SD of 10-sample assays, and the areas of positive expression of relevant factors are shown in Table 6

Table 6 Comparison of positive expression areas of liver-related factors in mice of each group

2.7 肝組織相關(guān)因子蛋白質(zhì)檢測

結(jié)果如Fig.4所示。與M組比較，E、EN、EP組各因子蛋白質(zhì)含量減少(P<0.01)，與E組比較，EN組各因子蛋白質(zhì)含量下降，EP組各因子蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升(P<0.05)。

Fig.4 Comparison of protein content of liver tissue-related factors in different groups of mice After aerobic exercise combined with intraperitoneal injection of sodium hydrosulfide enhancer (50 μmol/kg, 0.2 mL) and PAG inhibitor (40 mg/kg, 0.2 mL) for 7 weeks, changes in the protein content of liver tissue-related factors of mice in each group were detected. Values are the mean ± SD of 10 samples.**P<0.01, compared with K group;##P<0.01, compared with M group.&P<0.05, compared with group E

2.8 高通量測序分析

檢測結(jié)果見Fig.5所示。各組小鼠肝組織差異基因的整體分布情況，紅點表示上調(diào)，綠點表示下調(diào)。M組與E組比較，共11 713個基因表達存在差異。其中，8 649個表達上升，3 064個表達下降。在Toll樣受體抑制后誘發(fā)，多數(shù)基因與炎癥反應相關(guān)；EP組與E組比較，共4 932個基因表達存在差異。其中，722個表達上升，4 210個表達下降，多數(shù)基因與細胞增殖分化的調(diào)控及炎癥有關(guān)；EN組與E組比較，共1 295個基因表達存在差異。其中，454個表達上升，841個表達下降，相關(guān)基因主要與細胞損傷修復和心血管神經(jīng)變性的相關(guān)蛋白質(zhì)抑制劑有關(guān)。

Fig.5 Volcano plot of differentially expressed genes in liver tissue of mice in different groups The abscissa is the expression fold of different experimental groups/different samples, the ordinate is the statistical significance of the expression change. Red indicates up-regulated genes, green indicates down-regulated genes, and gray indicates unchanged genes

2.8.1 肝組織差異表達基因的 GO 統(tǒng)計 由Fig.6顯示，肝組織差異表達基因富集的顯著水平可知，差異表達基因中有294個基因富集于374條GO terms中，下調(diào)基因176個，在207條GO terms富集，108條富集于BP，50條富集于CC，149條富集于MF；上調(diào)基因118個，在57條GO terms富集，31條富集于BP，8條富集于CC，18條富集于MF。各組對比分析顯示：主要有Bcl-2、Nfkbid、NF-κB、MOX44、CTSK、ACK1、IL-1β、S1pr1、Ceacam1等9個基因具顯著差異，與細胞免疫應答、細胞分化、纖維化信號轉(zhuǎn)錄和細胞殺死等有關(guān)。涉及運動調(diào)控GO terms中，含20個基因，有NFKBID、BNIP、BMF、L-RR-8、CD209、Bcl-2和BMF等，BMF是誘發(fā)細胞損傷或凋亡的重要蛋白質(zhì)；NFKBID可介導NF-κB促進IL-2、TNF-αD等炎性細胞因子的釋放。可見，模型組上調(diào)基因中大多參與肝組織免疫細胞的應答，且與運動關(guān)系密切。

Fig.6 Histogram of GO statistics of differentially expressed genes in liver tissue The horizontal axis represents the specific term of the three basic GO categories BP, CC or MF. The vertical axis represents the number of genes annotated to a term, red represents the number of up-regulated expression, and green represents the number of down-regulated expression

2.8.2 肝組織差異表達基因的KEGG通路分析 實驗對3個比較組中KEGG相關(guān)通路(pathway)應用超幾何檢驗進行富集分析，找出差異表達基因顯著性富集的通路。紅色表示上調(diào)差異基因注釋在KEGG Orthology(KO)上，該KO顯示為上調(diào)。反之，綠色表示該KO下調(diào)。分析發(fā)現(xiàn)，部分差異表達基因顯著富集的KEGG通路包括：肝纖維化、炎性通路、脂肪消化吸收、色氨酸代謝、胰島素分泌、PPARs、甘油糖新陳代謝、氧化應激等多種代謝信號調(diào)節(jié)通路。與機體脂肪酸代謝、血脂異常、脂肪組織細胞代謝密切相關(guān)。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，給予有氧運動及硫化氫供體NaHS可促進肝組織脂肪氧化，同時降低脂肪蓄積。

2.9 不同干預方式對TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)因子的基因水平表達

研究結(jié)果正如Fig.8所示：相比M組(1.04±0.08)，E組(1.82±0.13)、EN組(2.11±0.18)CSEmRNA表達上升，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表達下降(P<0.01或P<0.05)；相比E組，EN組CSEmRNA表達增加，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表達降低(P<0.01)，EP組(1.12±0.11)CSEmRNA表達下降，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表達升高(P<0.01)，表明有氧運動可促進酒精性脂肪肝小鼠肝組織中CSE的基因水平，降低TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)炎性因子的表達，聯(lián)合NaHS干預效果更佳，聯(lián)合PAG干預可降低CSE的基因水平，促進炎性因子的表達。

Fig.7 KEGG enrichment results of related signaling pathway differential genes The hypergeometric test was used to analyze the enrichment of each pathway in KEGG. It was found that the differentially expressed genes were significantly enriched in the immune and lipid metabolism pathways, such as TNF-α, PI3K-AKT, PPARs and FAT signaling pathway. Red indicates up-regulated genes, and green indicates down-regulated genes

Fig.8 Gene expression results of liver tissue-related factors in mice in each group After 7 weeks of aerobic exercise combined with intraperitoneal injection of sodium hydrosulfide enhancer (50 μmol/kg, 0.2 mL) or PAG inhibitor (40 mg/kg, 0.2 mL), the gene expression of liver tissue-related factors in mice in each group was detected. Values are the mean ± SD of 10-sample assays,**P<0.01, compared with K group;##P<0.01, compared with M group;&&P< 0.01, compared with E

3 討論

3.1 酒精性肝損傷小鼠激活TLR4/NF-κB信號通路軸誘發(fā)炎癥

酒精濫用和酒精依賴已成為當今一個重要的公共衛(wèi)生問題。大部分酒精經(jīng)腸胃吸收入血，通過血液循環(huán)在肝內(nèi)發(fā)生氧化反應，但過量飲酒會導致肝組織脂代謝障礙和生成脂肪酸，肝細胞內(nèi)脂肪滴蓄積，形成脂肪肝[11, 12]。隨時間推移，肝細胞出現(xiàn)局灶性壞死，促使免疫細胞大量釋放非組蛋白染色體結(jié)合蛋白質(zhì)，致肝內(nèi)炎癥爆發(fā)[13]。同時，肝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激使IRE1α激活，造成IκBα磷酸化及NF-κB核易位，或由TNF-α、IL-1誘導Ser32/36上的IKK使IκBα磷酸化，促使p50/p65NF-κB二聚體進入細胞核，并激活基因轉(zhuǎn)錄誘發(fā)炎癥[14, 15]。El-Dessouki 等[16]發(fā)現(xiàn)，他莫昔芬誘導的肝損傷中，NF-κB基因可對肝細胞生長和炎癥反應進行負反饋調(diào)控，參與肝的脂質(zhì)生物合成與運輸或誘導細胞凋亡，抑制其表達可減輕肝細胞損傷。Mazur-Bialy 等[17]發(fā)現(xiàn)，運動時可促進肌肉釋放鳶尾素激素，降低TLR4和MyD88蛋白質(zhì)水平和NF-κB磷酸化作用，促炎因子關(guān)鍵蛋白質(zhì)釋放抑制。本文中，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織增重、臟器系數(shù)增高，肝功能指標、蛋白質(zhì)羰基化程度上升，血清H2S及肝組織CSE含量降低。肝組織顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，炎性細胞浸潤及脂滴空洞，TLR4、IL-1β、NF-κBmRNA表達上升。提示酒精的過量攝入會致使肝臟脂肪蓄積及炎癥浸潤，可能與TLR4的激活促進下游NF-κB等炎性通路，介導下游炎性信號因子的活化有關(guān)。

3.2 有氧運動干預下CSE/H2S體系介導TLR4/NF-κB途徑的抗炎效應

有氧運動對炎癥的改善作用已被證實，但有氧運動拮抗酒精性肝損傷炎癥的信號傳導機制很大程度上仍是未知的。H2S是機體內(nèi)源性信號傳導的氣體遞質(zhì)，主要由巨噬細胞中CSE合成，在炎癥中發(fā)揮核心作用，正成為炎癥中的新型調(diào)節(jié)劑[18]。Zheng 等[19]通過細胞研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)刺激后可經(jīng)TLR4-p38依賴性和TLR-4-NF-κB依賴性途徑增進炎性反應，同時刺激使巨噬細胞中CSE和H2S的生物合成增加拮抗炎癥；Benedetti 等[20]發(fā)現(xiàn)，促炎劑發(fā)酵支原體通過Toll樣受體介導的NF-κB活化來誘導促炎細胞因子MCP-1表達，而CSE/H2S可介導TLRs/NF-κB途徑減輕其炎癥。本文發(fā)現(xiàn)，CSE/H2ST體系可能通過介導TLR4/NF-κB信號途徑，參與有氧運動拮抗小鼠肝炎性損傷的轉(zhuǎn)歸過程。相比M組，E組小鼠CSEmRNA表達水平，H2S含量上升，TLR4/NF-κB途徑受到抑制，炎性反應減輕。結(jié)合肝功能指標、蛋白質(zhì)羰基化程度下降結(jié)果，肝細胞脂滴樣變減輕，損傷癥狀降低。測序結(jié)果顯示，有氧運動干預與CSE/H2S介導的TLR4/NF-κB炎性傳導途徑有著緊密聯(lián)系，提示有氧運動可升高肝組織CSE表達，促進H2S的合成。高表達的CD14可結(jié)合于LPS/LBP，介導LPS對細胞的刺激作用，激活單核細胞等分泌TNF、IL-1等細胞因子，介導一系列生理(免疫反應性強化)和病理(炎癥)反應，其可能的機制是有氧運動促進CSE/H2S體系的高表達，并介導TLR4/NF-κB傳導途徑的抑制，從而減輕炎癥反應過程。

3.3 H2S干擾下聯(lián)合有氧運動干預TLR4/NF-κB途徑的抗炎效應

為進一步確定有氧運動干預下CSE/H2S的高表達對肝損傷中TLR4/NF-κB介導的先天免疫信號轉(zhuǎn)導影響，本文采用注射H2S供體(NaHS)及抑制劑(PAG)對H2S的生成進行干擾。Tamizhselvi等[21]發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎小鼠在注射H2S抑制劑PAG后，可消除TLR4、IL-1受體相關(guān)激酶4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(CD120a、TNFRSF1A)和NF-κB的低表達水平，加重胰腺組織炎性損傷；注射NaHS后可降低TLR4/NF-κB炎性途徑相關(guān)因子表達，減輕炎性損傷。Han等[22]發(fā)現(xiàn)，PAG可降低CSE、H2S含量，增加TNF-α、IL-10表達水平，但NaHS給藥可進行逆轉(zhuǎn)。本文中，有氧運動干預后，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表達下調(diào)，對比分析E組與EN組、EP組可知，下調(diào)機制與肝組織CSE基因高表達及H2S含量升高密切相關(guān)，進行NaHS給藥可提升機體H2S含量，炎癥反應的拮抗效應增加，降低肝組織脂滴樣病變及炎性浸潤；給藥PAG可逆轉(zhuǎn)有氧運動對肝組織炎癥及損傷的改善效應，肝組織脂滴蓄積與損傷增加。結(jié)果表明，有氧運動對酒精性肝損傷肝功能的恢復、脂肪蓄積及炎癥反應有明顯改善作用，可能與H2S介導的抑制TLR4/NF-κB炎癥傳導途徑有關(guān)，且聯(lián)合NaHS給藥干預效果更佳。

CSE/H2S氣體信號體系對酒精性肝損傷后小鼠肝組織炎癥有重要調(diào)控作用，7周有氧運動可促進CSE/H2S體系，從而抑制肝組織TLR4/NF-κB信號通路以及下游相關(guān)炎性因子的表達，減弱小鼠肝組織炎性損傷及肝的脂質(zhì)變性，且有氧運動結(jié)合外源性硫化氫供體NaHS給藥干預效果更佳。