陳觀盛， 鄭 蓉

(北京積水潭醫(yī)院婦產(chǎn)科， 北京 100035)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMS)是指子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位發(fā)生具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織，屬于具有惡性生物學(xué)行為的良性婦科疾病。在臨床中發(fā)現(xiàn)，EMS患者異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、血管生成、細(xì)胞無限增殖生物學(xué)行為均與惡性腫瘤相似[1]。雖然屬于良性疾病，但仍會對患者造成較大心理壓力，對患者生活也可造成一定影響，早期診斷是治療與預(yù)防EMS發(fā)生的關(guān)鍵。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)為分泌性的磷酸化糖蛋白，在大腸癌、卵巢上皮性癌、肝癌等惡性腫瘤中均為高表達(dá)，且與腫瘤黏附、轉(zhuǎn)移、凋亡之間關(guān)系密切[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子2(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2，TIMP-2)是組織抑制因子中的一員，具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)的作用，可調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)中MMP的降解，在惡性腫瘤的侵襲過程中發(fā)揮著重要的作用[3]。在以往多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中存在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)過度活化現(xiàn)象，EMS病灶形成與腫瘤轉(zhuǎn)移之間非常相似，因此認(rèn)為STAT3激活與EMS組織遷徙與侵入可能存在聯(lián)系[4,5]?；诖?，本文旨在分析OPN、TIMP-2及 STAT3蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥患者中的表達(dá)情況，了解其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月至2020年1月在本院收治的117例子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床資料(EMS組)，患者年齡26～60歲，平均(38.77±5.16)歲，根據(jù)美國生育協(xié)會評分標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS)分期[6]，Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期64例；月經(jīng)周期：增生期66例，分泌期51例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)后病理檢查確證(病理檢查可見異位內(nèi)膜伴有周圍纖維組織增生和粘連形成，有大小不等的紫藍(lán)色結(jié)節(jié)或包塊。切開結(jié)節(jié)或包塊可看到陳舊性出血和瘢痕。鏡下檢查可見子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)。)；②符合EMS疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：患者有疼痛(非經(jīng)期下腹痛、痛經(jīng)、深部性交痛等)、不孕、月經(jīng)失調(diào)等癥狀；超聲檢查可見子宮的后方或側(cè)方包塊，包膜粗糙，內(nèi)為密集細(xì)小強(qiáng)光點反射或不規(guī)則反射，彩超包塊內(nèi)無血流；腹腔鏡檢查下可見病灶。③臨床資料完整；④自愿加入本次研究，家屬及患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在感染性疾病或自身免疫性疾??；②合并惡性腫瘤者；③在入院前3個月內(nèi)有進(jìn)行內(nèi)分泌激素治療者；④存在其他婦科感染性疾病或炎性疾病者。另選取同期收治子宮肌瘤或不孕癥行手術(shù)治療的非EMS者103例，年齡26～61歲，平均(39.56±5.37)歲。兩組一般資料比較并無差異，具有可比性(P>0.05)。見表1。

表1 一般資料比較

1.2OPN、TIMP-2及STAT3檢測方法：使用免疫印跡實驗檢測TIMP-2及STAT3蛋白含量，所有患者均在術(shù)中獲取子宮內(nèi)膜組織100mg，提取蛋白后進(jìn)行下一步檢測，按照配方配置濃縮膠(4%)、分離膠(10%)，將樣本加入到點樣孔中，垂直進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)膜。使用脫脂牛奶(5%)封閉，在2h后根據(jù)抗體說明書進(jìn)行蛋白分子量預(yù)測，進(jìn)行NC膜裁剪，孵育OPN、TIMP-2及STAT3第一抗體。在第2天將NC膜取出，使用TBST洗滌液洗滌3遍后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2h，再次使用TBST洗滌液洗滌3次進(jìn)行顯影處理，隨后使用相應(yīng)軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，根據(jù)基因灰度值/內(nèi)參actin灰度值作為蛋白含量，令對照組蛋白含量為100，計算蛋白含量。OPN使用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測，在患者入院后抽取靜脈血液4mL，使用離心機(jī)離心5min(速度3000r/min，半徑10cm)試劑為武漢博士德股份有限公司提供。使用酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司，型號：Synergy H1)檢測450nm處的吸光度(OD值)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出相應(yīng)的濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1不同人群中OPN、TIMP-2及STAT3表達(dá)情況比較：EMS組OPN、STAT3表達(dá)明顯高于對照組，TIMP-2水平則明顯低于對照組，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同人群中OPN TIMP-2及 STAT3表達(dá)情況比較

2.2不同分期患者OPN、TIMP-2及STAT3表達(dá)情況比較：Ⅲ～Ⅳ期OPN、STAT3表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，TIMP-2水平則明顯低于Ⅰ～Ⅱ期，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同分期患者OPN TIMP-2及STAT3表達(dá)情況比較

2.3不同月經(jīng)周期患者OPN、TIMP-2及STAT3表達(dá)情況比較：增生期OPN、STAT3表達(dá)明顯高于分泌期，TIMP-2水平則明顯低于分泌期，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同月經(jīng)周期患者OPN TIMP-2及STAT3表達(dá)情況比較

2.4OPN、TIMP-2及STAT3與r-AFS分期相關(guān)性：EMS患者血清OPN、STAT3值與患者r-AFS分期為正相關(guān)，TIMP-2與r-AFS分期為負(fù)相關(guān)，相關(guān)關(guān)系存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 OPN TIMP-2及STAT3與r-AFS分期相關(guān)性

3 討 論

OPN作為一種分泌型酸性蛋白和細(xì)胞的遷移、分化之間密切相關(guān)。OPN可通過與某些分子相結(jié)合發(fā)揮激活一系列細(xì)胞信號，促進(jìn)細(xì)胞不斷增生，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生；通過與整合素dvB3結(jié)合可引起多種蛋白溶解酶合成且分泌到細(xì)胞外，進(jìn)而溶解細(xì)胞外基質(zhì)屏[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，OPN可能與EMS發(fā)生存在密切的聯(lián)系，在EMS中表達(dá)明顯升高，與其可促進(jìn)細(xì)胞黏附、浸潤以及血管生成等有關(guān)[8]。在本研究中OPN在EMS中表達(dá)明顯高于對照組，且隨著分期增加其表達(dá)也明顯上升，提示OPN可能參與EMS發(fā)生、發(fā)展過程。在以往研究中有學(xué)者通過檢測OPN在EMS患者異位組織中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，OPN呈高表達(dá)，認(rèn)為OPN和EMS形成之間存在密切的聯(lián)系[9]。而本研究也表明OPN與EMS患者r-AFS分期呈正相關(guān)，結(jié)合以往研究分析，可能與OPN可改變細(xì)胞骨架促進(jìn)細(xì)胞黏附與游走有關(guān)[10]。此外在患者增生期時OPN表達(dá)比分泌期高，說明在增生期更有助于EMS患者子宮內(nèi)膜異位種植和轉(zhuǎn)移。

TIMP-2主要在EMS患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞中分布，在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較低。在以往研究中顯示，基底膜的完整性是判斷異位內(nèi)膜浸潤與侵襲的重要標(biāo)志，TIMP-2在這一過程的調(diào)節(jié)中具有特殊的意義，可控制細(xì)胞外基質(zhì)的降解合成[11]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，TIMP-2在EMS患者中表達(dá)明顯低于對照組，且隨著患者病情發(fā)展r-AFS分期升高其表達(dá)為逐漸降低的趨勢，與r-AFS分期呈負(fù)相關(guān)，在增生期時TIMP-2值明顯降低。在以往研究中也發(fā)現(xiàn)，在EMS患者異位組織中TIMP-2表達(dá)明顯降低，而MMPs表達(dá)明顯增高，兩者之間表達(dá)失衡，TIMP-2對MMP的作用降低，導(dǎo)致異位內(nèi)膜中的MMPs水解蛋白活性增加，異位的侵襲與種植能力就會增加，進(jìn)而導(dǎo)致EMS發(fā)生[12]。也有動物研究發(fā)現(xiàn)，將人子宮內(nèi)膜立即注入裸鼠腹腔內(nèi)，子宮內(nèi)膜仍可分泌出MMPs，并可在腹腔內(nèi)種植，但在注射TIMPs后MMPs分泌被抑制，阻礙了異位病灶的發(fā)生[13]。以上研究結(jié)果說明TIMP-2在患者異位組織中表達(dá)降低，無法抑制MMPs，從而促進(jìn)ESM發(fā)展。

STAT3在機(jī)體多種細(xì)胞及組織中均有表達(dá)，磷酸化后可被激活從而進(jìn)入到細(xì)胞核中，并通過與起動因子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá)，從而來參與到細(xì)胞的生物學(xué)行為中。臨床中發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路與細(xì)胞分化、增殖及侵襲之間密切相關(guān)。在本研究中EMS患者中STAT3表達(dá)明顯高于對照組，且隨著患者分期增加，其表達(dá)也明顯增加，提示EMS患者中存在STAT3過度活化現(xiàn)象。在以往研究中發(fā)現(xiàn)，EMS患者腹腔積液中存在大量促炎性因子，這是激活JAK/STAT3通路的重要刺激因子，也可能是導(dǎo)致EMS患者STAT3過度活化的原因之一[14]。同時也有研究顯示，STAT3過度活化可參與子宮內(nèi)膜的蛻膜化，在女性受孕過程中具有重要的作用[15]。在本研究中患者STAT3在增生期水平高于分泌期，說明STAT3活化異?？赡芘c子宮內(nèi)膜蛻膜化分化功能異常有關(guān)。

綜上所述，在EMS患者中OPN、STAT3表達(dá)增加、TIMP-2表達(dá)下調(diào)，三者與患者發(fā)生與病情進(jìn)展間關(guān)系密切，監(jiān)測三者表達(dá)情況可為疾病發(fā)展預(yù)測及轉(zhuǎn)歸提供參考。