張俊娣， 翟佳佳， 左志洪

(1.河北省廊坊市人民醫(yī)院， 河北 廊 坊 065000 2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院， 河北 石家莊 050000)

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)通過導入細胞或組織內(nèi)的雙鏈 RNA(double-strand RNA，dsRNA)引起特異性的同源 mRNA 的降解或抑制翻譯，導致相應蛋白功能受損。1998年，研究者首次在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegan，C.elegans)揭示了 RNAi 現(xiàn)象，眾多研究團隊借助 RNAi 展開相關研究。C.elegans 基因組中與人類同源的基因高達 60%-80%，是第一個完成全基因組測序的動物[1]。目前已建立了包含87% C.elegans 已知基因的 RNA 干擾菌庫，并且線蟲的 RNAi 技術發(fā)展成熟且操作簡單，可以對靶基因?qū)嵤┒ㄏ虺聊琜2]，這使得我們通過 RNAi 來進行遺傳篩選具有可行性。C.elegans[3]是一種食細菌的線性動物，因其尺寸小、身體透明易觀察、生活史時間短和易于培養(yǎng)等優(yōu)勢，成為了生物學實驗重要的體內(nèi)模式生物[4]。C.elegans從蟲卵發(fā)育到成蟲僅需3～4d，平均壽命大約為2～3周，是研究胚胎發(fā)育的良好載體。小頭激酶2(minibrain kinase 2，mbk-2)可以通過調(diào)節(jié)微管蛋白從而影響早期胚胎發(fā)育[5]，是早期胚胎發(fā)育的重要調(diào)節(jié)蛋白。通過對mbk-2 RNAi篩選，發(fā)現(xiàn)了4種mbk-2的增強子(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)。由于RNAi可以有效的避免因某些基因功能缺失所引起的發(fā)育初期卵和幼蟲的死亡，因此RNAi技術是研究胚胎發(fā)育初期相關基因的的有力手段。在本研究中，課題組借助RNAi技術深入的研究了mbk-2其及增強子在胚胎早期發(fā)育過程中的作用，以期為相關研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1秀麗隱桿線蟲株系:野生型N2、mbk-2突變型線蟲株系和OP50(大腸艾希桿菌)自美國秀麗線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center)購買。

1.2儀器及試劑:羧芐青霉素(美國SigmaA6140)；氨芐青霉素(上海BBI，A610028)；L4440質(zhì)粒(美國Addgene)；氯化鈉、蛋白棟和瓊脂(北京索萊寶)。體式解剖顯微鏡(廈門Motic)；低溫高速離心機(德國eppendorf)；激光共聚焦成像系統(tǒng)(德國Leica)。

1.3實驗方法

1.3.1線蟲生長培養(yǎng)基：稱取1.5g NaCl、10g瓊脂、1.3g蛋白胨，加入487mL ddH2O溶解上述試劑，高壓玻璃紙封口，放入高壓鍋中滅菌。滅菌完成后，待培養(yǎng)基冷卻后加入0.5mL Cacl2(1moL/L)、0.5mL膽固醇(5mg/mL)、0.5mL MgSO4(1moL/L)和12.5mL KPO4(1moL/L)緩沖液，倒入無菌培養(yǎng)皿中。NGM平板培養(yǎng)基室溫放置2d后，滴加OP50菌，室溫放置后用于培養(yǎng)線蟲培養(yǎng)。

1.3.2線蟲同步化培養(yǎng)：將生化培養(yǎng)箱溫度設定為20℃，線蟲放在NGM培養(yǎng)板上進行常規(guī)培養(yǎng)。用2mL Bleach裂解液沖洗NGM培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)移秀麗線蟲到1.5mL EP管中，渦旋震蕩，低速離心，棄上清。加入S-basal溶液，震蕩混勻，低速離心，棄上清，重復至少兩次以上操作。然后，加入S-buffer溶液重懸，放入生化培養(yǎng)箱25℃，恒溫過夜培養(yǎng)。次日，離心后棄上清，剩余部分混勻，均勻涂在NGM培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)。觀察線蟲至起進入產(chǎn)卵期，將該階段的線蟲挑到NGM培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)卵。培養(yǎng)2～3h后將線蟲(母蟲)挑走，將NGM平板放入生化培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。次日，觀察存活情況，待發(fā)育至L4期(成蟲)后進行后續(xù)相關實驗。

1.3.3RNAi干擾試驗:將含目的基因(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)的RNAi菌株，涂布在LB固體培養(yǎng)基(含抗生素)上，37℃培養(yǎng)15h左右。將LB固體培養(yǎng)基上的RNAi菌落挑至LB液體培養(yǎng)基(含50g/L氨芐青霉素、12.5g/L四環(huán)素和1mmoL/L IPTG)中于37℃震蕩過夜。次日，將含不同mbk-2增強子的菌液滴加在NGM瓊脂平板上(含100g/L氨芐青霉素、12.5g/L四環(huán)素和1mmoL/L IPTG)，室溫誘導過夜。將上一步中同步化好的N2及mbk-2基因突變線蟲各分為6組，每組3個亞組，每亞組50只線蟲。在NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至L4期，喂食含目的基因(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)RNAi菌株，N2野生型及mbk-2基因突變線蟲喂食含L4440空載質(zhì)粒的RNAi菌株。

1.3.4孵化率測定:取300μL含RNAi菌株的培養(yǎng)基加至培養(yǎng)基平板，進行線蟲培養(yǎng)。觀察線蟲發(fā)育至L4期，選取一定數(shù)量的線蟲轉(zhuǎn)移至含有30μL RNAi菌株的新的瓊脂培養(yǎng)基上，孵育24h。將新的成蟲轉(zhuǎn)移到含特定增強子RNAi菌株的新平板上，培養(yǎng)24h后移除成蟲。將平板上的子代放于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)并對產(chǎn)卵數(shù)進行統(tǒng)計，未孵化率=蟲卵數(shù)/產(chǎn)卵數(shù)。

1.3.5線蟲胚胎觀察:線蟲從L1階段喂食含有特定增強子的RNAi菌株，直到線蟲產(chǎn)卵前2d。將事先準備好的0.4mm瓊脂墊和蓋玻片以及M9緩沖液放入生化培養(yǎng)箱37℃孵育2h。使用移液槍小心滴加2μL的M9緩沖液至蓋玻片，之后解剖10只左右處于產(chǎn)卵期的成蟲，使用凡士林進行封片，DIC觀察記錄。通過DIC觀察，記錄蟲卵補充的分裂階段以及相關細胞器的變化。

2 結(jié) 果

2.1mbk-2增強子對N2野生型線蟲蟲卵孵化的影響:與N2+L4440組相比，mbk-2+L4440(RNAi)組蟲卵未孵化率顯著升高(P<0.05)。將含有mbk-2增強子(pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2)的RNAi細菌喂養(yǎng)線蟲，觀察抑制mbk-2增強子對N2野生型線蟲蟲卵孵化率的影響。結(jié)果顯示，喂養(yǎng)pptr-1 RNAi細菌的N2野生型線蟲蟲卵未孵化率與N2 野生型線蟲蟲卵未孵化率相同，無統(tǒng)計學差異；喂養(yǎng)pptr-2、rsa-1和rsa-2 RNAi 細菌N2野生型線蟲蟲卵未孵化率顯著高于N2+L4440 組(P<0.05)。見表1。

表1 N2野生型線蟲RNAi蟲卵未孵化率

2.2沉默mbk-2增強子對mbk-2突變型線蟲蟲卵孵化的影響:我們采用pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2的RNAi細菌喂養(yǎng)mbk-2突變型線蟲，觀察抑制pptr-1、pptr-2、rsa-1和rsa-2對mbk-2突變型線蟲的影響。結(jié)果顯示，沉默mbk-2突變型線蟲mbk-2增強子后，四個沉默組蟲卵未孵化率相較于mbk-2突變型線蟲顯著升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與mbk-2+pptr-1(RNAi)組相比，其余增強子沉默組蟲卵未孵化率顯著升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果顯示pptr基因中pptr-2增強子未孵化率顯著高于pptr-1增強子(P<0.05)。同時rsa基因中rsa-2增強子未孵化率顯著高于rsa-1增強子(P<0.05)。見表2。

表2 mbk-2突變線蟲RNAi蟲卵孵化率統(tǒng)計

2.3rsa-2和pptr-2基因沉默對mbk-2突變型線蟲胚胎發(fā)育表型的影響:為了進一步研究mbk-2及其pptr和rsa增強子基因在胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控作用，我們分別選取了pptr基因中未孵化率較高的增強子pptr-2和rsa基因中未孵化率較高的增強子rsa-2增強子基因進行進一步研究。rsa-2和pptr-2 RNAi細菌喂養(yǎng)mbk-2突變型線蟲，并通過DIC對胚胎發(fā)育進行觀察。結(jié)果顯示，在胚胎發(fā)育單細胞階段，mbk-2+rsa-2(RNAi)組相較于其余組在原核遷移方面(原核相遇沒有接近細胞后部和原核沒有移至胚胎中央)存在明顯差異(P<0.05)。在胚胎發(fā)育的四細胞階段，mbk-2+pptr-2(RNAi)組在細胞大小差異、多細胞核和細胞間接觸異常等方面與其余組有明顯差異(P<0.05)。見表3。

表3 線蟲胚胎發(fā)育表型檢測

3 討 論

線蟲的生命周期包括胚胎發(fā)育期、生產(chǎn)發(fā)育期、生殖期和生殖后期四個階段[6]。Sulston第一次描述了C.elegans從受精卵到成蟲的細胞譜系圖，這也是多細胞生物唯一的一張細胞譜系圖，這為其他研究者進行胚胎發(fā)育、細胞凋亡和性別決定等的相關研究奠定了基礎[7]?；诰€蟲胚胎發(fā)育周期短以及發(fā)育圖譜明確的前提下，利用RNAi技術特異性的沉默與胚胎發(fā)育相關的靶基因，可以特異性的研究該基因在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮的調(diào)控作用。因此，本研究利用RNAi技術特異性的沉默線蟲mbk-2及其增強子的表達，深入探討其在胚胎早期發(fā)育的調(diào)控作用。

mbk-2在胚胎發(fā)育階段可以發(fā)揮調(diào)控紡錘體方向、原核遷移和微管穩(wěn)定性等作用，對于胚胎的早期發(fā)育至關重要。結(jié)果顯示，抑制mbk-2增強子可以顯著提高蟲卵未孵化率，進一步證明了mbk-2及其增強子在胚胎發(fā)育早期階段發(fā)揮重要的作用。然而，實驗結(jié)果顯示抑制pptr-1的表達，蟲卵未孵化率(0)與N2野生型沒有統(tǒng)計學差異。我們猜測，可能是線蟲體內(nèi)有其它蛋白可以起到同等的替代作用或者是其增強作用不顯著，在后續(xù)研究中我們將對其進行深入研究。表1中結(jié)果顯示，除pptr-1外，其余三個增強子均可導致野生型線蟲蟲卵未孵化率升高，這表明其余三個增強子存在mbk-2基因以外調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的途徑。

本研究結(jié)果顯示mbk-2基因的調(diào)控作用對其增強子有較強的依賴作用。然而如表2中顯示，在mbk-2突變型線蟲中增強子pptr-1喂食組蟲卵未孵化率為3.78±0.14%，而野生組為0。以上結(jié)果表明，mbk-2基因可能是pptr-1調(diào)控胚胎發(fā)育所必需的。文獻指出，rsa-1、pptr-1和pptr-2是蛋白磷酸化酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的亞單位，而PP2A是細胞有絲分裂的調(diào)節(jié)酶，與細胞進入有絲分裂周期、染色體向中板集合以及紡錘體集中的管卡密切相關[8]。rsa-1和rsa-2形成的復合物(RSA復合物)在有絲分裂紡錘體的形成中起作用，同時RSA復合物可以被募集至中心體中[9]，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)有絲分裂的作用。我們猜測，mbk-2增強子可能也通過以上途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育的功能。選取pptr基因中未孵化率較高的增強子pptr-2和rsa基因中未孵化率較高的基因rsa-2進行影像分析。于是我們采用DIC觀察pptr-2和rsa-2組在胚胎早期不同階段的作用。以上結(jié)果揭示，pptr-2和rsa-2通過與mbk-2相互作用在胚胎發(fā)育階段均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，然而其調(diào)節(jié)的階段可能不同，后續(xù)我們也將進一步研究mbk-2及其不同增強子在有絲分裂過程中的具體調(diào)節(jié)作用。