黃 亮, 黃 旭, 張冠男

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科, 河北 承 德 067000 2.北京市大興區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普胸外科， 北京 大興區(qū) 100076)

肺癌是一類起源于支氣管黏膜上皮或腺體的惡性腫瘤，已成為我國城鄉(xiāng)居民因惡性腫瘤死亡原因的主要原因之一。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌患者總數(shù)的80%～85%，也是臨床上最常見的肺癌類型[1]。鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因和Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)基因是NSCLC的主要驅(qū)動(dòng)基因，二者發(fā)生突變的檢出率分別為15%～25%和0.5%～4.9%[2]。研究表明，BRAF突變和KRAS突變可降低NSCLC細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物的敏感性，嚴(yán)重影響NSCLC患者的化療預(yù)后[3]。因此，開發(fā)針對(duì)BRAF/KRAS突變的治療方案顯得尤為重要。巴馬汀屬于季銨鹽異喹啉類生物堿，最初由防己科植物黃藤的干燥藤莖中提取。研究表明，巴馬汀具有多種藥理學(xué)效應(yīng)，包括促炎癥消退、抗氧化、抗細(xì)菌和抗病毒作用[4]。近年來，眾多研究者發(fā)現(xiàn)，巴馬汀可選擇性抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而不影響正常組織[4,5]。因此，本研究旨在探討巴馬汀對(duì)BRAF/KRAS雙突變NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡和順鉑化療敏感性的影響，以期為臨床治療NSCLC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:人BRAF/KRAS雙突變NSCLC細(xì)胞株A549購自上海博谷生物科技有限公司。巴馬汀和順鉑購自美國Sigma公司。胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抗體和α-微管蛋白(α-tubulin)抗體均購自美國abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理:取出凍存的A549細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在98%濕度、5% CO2和37℃條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)，將其接種于96孔板。在第一部分研究中，將A549細(xì)胞分為4組：①對(duì)照組：不加任何藥物處理A549細(xì)胞48h；②1μmoL/L組：加入1μmoL/L巴馬汀處理A549細(xì)胞48h；③5μmoL/L組：加入5μmoL/L巴馬汀處理A549細(xì)胞48h；④10μmoL/L組：加入10μmoL/L巴馬汀處理A549細(xì)胞48h；在第二部分研究中，將A549細(xì)胞分為4組：①對(duì)照組：不加任何藥物處理A549細(xì)胞48h；②巴馬汀組：加入10μmoL/L巴馬汀處理A549細(xì)胞48h；③順鉑組：加入6μmoL/L順鉑處理A549細(xì)胞48h；④順鉑+巴馬汀組：分別加入6μmoL/L順鉑和10μmoL/L巴馬汀處理A549細(xì)胞48h。

1.3細(xì)胞活力檢測(cè):棄去培養(yǎng)液，加入PBS溶液沖洗，每孔加入20μL MTT溶液，將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育3h。棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜溶液，輕輕晃動(dòng)96孔板，使結(jié)晶充分溶解。將96孔板置于酶標(biāo)儀中，檢測(cè)各組細(xì)胞在490nm處的吸光度值(OD值)。細(xì)胞活力(%)=(加藥孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):棄去培養(yǎng)液，加入PBS溶液沖洗并收集A549細(xì)胞。將離心管置于離心機(jī)中，2500r/min離心5min，棄去上清液，加入100μL的1×結(jié)合緩沖液以重懸細(xì)胞。分別加入5μL Annexin V-FITC溶液和5μL PI溶液，37℃避光孵育10min，將細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀中，檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Western blotting檢測(cè):利用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗膜3次。將PVDF膜分別放入Bcl-2、PARP和α-tubulin抗體中，4℃孵育過夜，漂洗后加入適量的二抗，室溫孵育1h，利用Odyssey凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。以α-tubulin為內(nèi)參，分析Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:利用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度巴馬汀對(duì)細(xì)胞活力的影響:與對(duì)照組比較，1μmoL/L、5μmoL/L和10μmoL/L組細(xì)胞的增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.647,P<0.05)；與1μmoL/L組比較，5μmoL/L和10μmoL/L組細(xì)胞的增殖活力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=87.179,P<0.05)；與5μmoL/L組比較，10μmoL/L組細(xì)胞的增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.667,P<0.05)。見圖1。

2.2不同濃度巴馬汀對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:與對(duì)照組比較，1μmoL/L、5μmoL/L和10μmoL/L組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.119,P<0.05)；與1μmoL/L組比較，5μmoL/L和10μmoL/L組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.273,P<0.05)；與5μmoL/L組比較，10μmoL/L組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.525,P<0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度巴馬汀對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.3不同濃度巴馬汀對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較，1μmoL/L、5μmoL/L和10μmoL/L組細(xì)胞的Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FBcl-2=52.413,FPARP=65.669,P<0.05)；與1μmoL/L組比較，5μmoL/L和10μmoL/L組細(xì)胞的Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FBcl-2=31.693,FPARP=33.028,P<0.05)；與5μmoL/L組比較，10μmoL/L組細(xì)胞的Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tBcl-2=4.118,tPARP=3.576,P<0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度巴馬汀對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4巴馬汀聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響:與對(duì)照組比較，巴馬汀組和順鉑組細(xì)胞的增殖活力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.783,P<0.05)；與順鉑組比較，順鉑+巴馬汀組細(xì)胞的增殖活力進(jìn)一步降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.684,P<0.05)。見圖4。

圖4 巴馬汀聯(lián)合順鉑對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

2.5巴馬汀和順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:與對(duì)照組比較，巴馬汀組和順鉑組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=128.199,P<0.05)；與順鉑組比較，順鉑+巴馬汀細(xì)胞的凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.536,P<0.05)。見圖5。

圖5 巴馬汀和順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.6巴馬汀和順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:與對(duì)照組比較，巴馬汀組和順鉑組細(xì)胞的Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FBcl-2=59.186,FPARP=68.783,P<0.05)；與順鉑組比較，順鉑+巴馬汀組細(xì)胞Bcl-2和PARP蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tBcl-2=3.514,tPARP=4.348,P<0.05)。見圖6。

圖6 巴馬汀和順鉑對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

NSCLC的發(fā)生、發(fā)展受多種因素調(diào)控，多種原癌基因參與NSCLC細(xì)胞的增殖、分化和存活。KRAS基因定位于人12號(hào)染色體短臂，編碼21kD的鳥苷酸結(jié)合蛋白，又稱為p21基因。正常情況下，KRAS蛋白處于失活狀態(tài)，而當(dāng)KRAS基因突變后，KRAS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并一直處于激活狀態(tài)，從而持續(xù)刺激細(xì)胞生長，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[3]。BRAF基因定位于人7號(hào)染色體長臂，通過編碼具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的Raf蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明，BRAF突變可增強(qiáng)BRAF蛋白激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖和分化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6]。亦有研究指出，BRAF/KRAS突變與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)[7]。因此，尋找針對(duì)靶向BRAF/KRAS突變的藥物對(duì)于治療和改善NSCLC患者預(yù)后具有重要的臨床意義。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)，巴馬汀可選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而不影響正常組織[5]。研究表明，巴馬汀對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有相對(duì)選擇性，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[5]。Liu等也證實(shí)，巴馬汀可下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[8]。本研究采用不同濃度的巴馬汀處理BRAF/KRAS突變A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬汀可明顯抑制A549細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)其凋亡，提示巴馬汀具有抗腫瘤效應(yīng)。

目前，順鉑被用作一線晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)化療方案。然而，BRAF/KRAS突變可降低NSCLC細(xì)胞對(duì)以順鉑為主的化療產(chǎn)生耐藥性[9]。既往研究表明，巴馬汀可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，并增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[5]。本研究評(píng)估了巴馬汀對(duì)順鉑抗腫瘤作用的影響。結(jié)果表明，巴馬汀和順鉑處理均能降低NSCLC細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，巴馬汀和順鉑聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步降低NSCLC細(xì)胞的增殖活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示巴馬汀可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的化療敏感性。

研究表明，順鉑誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的過程依賴于正常的細(xì)胞凋亡途徑，若細(xì)胞抗凋亡機(jī)制增強(qiáng)或凋亡通路缺陷，則容易出現(xiàn)耐藥[10]。Bcl-2基因是目前研究的最深入、最廣泛的凋亡抑制基因之一，過表達(dá)的Bcl-2可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷因子的抵抗性，抑制順鉑引起的靶細(xì)胞凋亡。PARP是一種DNA損傷修復(fù)酶，也是細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶的切割底物，在DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[11]。本研究結(jié)果顯示，巴馬汀處理BRAF/KRAS突變A549細(xì)胞后，Bcl-2和PARP表達(dá)均明顯下調(diào)，細(xì)胞凋亡率明顯升高。此外，巴馬汀和順鉑聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步降低Bcl-2和PARP表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示巴馬汀通過靶向凋亡抑制基因，增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞的化療敏感性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，巴馬汀可抑制BRAF/KRAS突變NSCLC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤活性。因此，巴馬汀可能是治療BRAF/KRAS突變NSCLC的潛在藥物。