寧燕華 ，施國(guó)元 ，陳世好 ，梁丹 ，賴朝培

(廣西欽州市第一人民醫(yī)院 a.病理科，b.耳鼻喉科，廣西欽州 535000)

鼻咽癌是臨床上較為常見的一種EB病毒相關(guān)性惡性腫瘤，我國(guó)廣西是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)之一，亦是少數(shù)民族聚集地，存在人群遺傳背景的特點(diǎn)。鼻咽癌的發(fā)病部位是鼻咽黏膜上皮，上可侵入顱底，下可引發(fā)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，盡管醫(yī)療技術(shù)與日俱進(jìn)，大部分患者均可獲得較佳的臨床治療效果，但仍有部分患者預(yù)后不良。鼻咽癌的準(zhǔn)確診斷對(duì)臨床治療方案的制定具有極其重要的意義，亦是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。然而，由于鼻咽癌具有較強(qiáng)的隱匿性，大部分患者一經(jīng)確診便已是中晚期，預(yù)后往往較差。故此，如何有效診治鼻咽癌顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的熱點(diǎn)。隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，P53及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等基因于多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均起著至關(guān)重要的作用。由此，本文通過研究P53及EGFR表達(dá)與廣西北部灣地區(qū)鼻咽癌患者臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，旨在為臨床鼻咽癌的診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

納入廣西北部灣地區(qū)醫(yī)院從2014年2月—2016年12月收治的鼻咽癌患者60例進(jìn)行研究。其中男性患者28例，女性患者32例；年齡31～78歲，平均(57.22±10.24)歲；體重指數(shù)(BMI)值18～27 kg/m，平均BMI值(23.84±1.35)kg/m；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者居住于廣西北部灣地區(qū)時(shí)間在1年以上；(2)年齡均在18周歲以上；(3)入院前尚未接受手術(shù)、化療、放療以及生物治療等相關(guān)抗腫瘤治療；(4)無(wú)臨床病歷資料缺失；(5)所有受試者均經(jīng)病理檢查確診為低分化鱗狀細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)伴有嚴(yán)重感染性疾病、免疫性疾病以及血液系統(tǒng)疾病者；(3)心、肝、腎等重要臟器發(fā)生損傷者；(4)意識(shí)障礙或伴有精神疾病者；(5)研究期間因故退出或失訪者。納入對(duì)象均在知情同意書上簽字，并獲批于醫(yī)院倫理委員會(huì)。

采集所有受試者接受治療前的鼻咽癌組織以及癌旁正常組織，采用4%的福爾馬林實(shí)施固定處理，并以乙醇完成脫水。隨后將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，通過石蠟切片機(jī)制成厚度為4 μm的連續(xù)切片。采用二甲苯脫蠟以及酒精脫水處理切片標(biāo)本，同時(shí)浸泡于PBS液中5 min。予以高壓抗原修復(fù)3次后將其放置在室溫下自然冷卻，然后予以3%過氧化氫孵育，達(dá)到滅活內(nèi)源性生物素以及過氧化物酶活性的目的。予以PBS液重復(fù)沖洗3次，2 min/次，沖洗結(jié)束后添加正常山羊血清封閉，放置在室溫內(nèi)繼續(xù)孵育10 min。分別加入鼠抗人P53單克隆抗體以及兔抗人EGFR單克隆抗體，并置于4 ℃條件下冷藏過夜。待恢復(fù)常溫后繼續(xù)滴加二抗于室溫條件下孵育，在此予以PBS液重復(fù)沖洗3次，5 min/次。實(shí)施DAB顯色，予以自來水重復(fù)沖洗3次，2 min/次，蘇木精復(fù)染，無(wú)水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，予以中性樹膠封片晾干觀察。

P53及EGFR均以細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽(yáng)性，前者主要定位于細(xì)胞核，后者定位于細(xì)胞漿與細(xì)胞膜。判定標(biāo)準(zhǔn)主要是根據(jù)染色結(jié)果評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分進(jìn)行最后評(píng)分，其中染色評(píng)分如下：無(wú)色即為0分；黃色即為1分；棕黃色即為2分；棕褐色即為3分。陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分如下：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞即為0分；陽(yáng)性細(xì)胞占比低于10%即為1分；陽(yáng)性細(xì)胞占比在11%～50%之間即為2分；陽(yáng)性細(xì)胞占比在51%～80%之間即為3分；陽(yáng)性細(xì)胞超過80%即為4分。以染色評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分的乘積作為最后結(jié)果，若乘積<6分即為陰性，≥6分即為陽(yáng)性。

(1)比較鼻咽癌組織及癌旁正常組織中P53及EGFR蛋白表達(dá)情況；(2)分析鼻咽癌組織中P53及EGFR陽(yáng)性表達(dá)與鼻咽癌患者的臨床特點(diǎn)關(guān)系；(3)對(duì)所有患者進(jìn)行為期3年的隨訪觀察，比較不同生存狀況患者P53及EGFR蛋白表達(dá)情況；(4)分析鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

以SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以[(%)] 表示，進(jìn)行連續(xù)性校正χ檢驗(yàn)以及McNemar χ檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性分析鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達(dá)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié) 果

鼻咽癌組織中P53蛋白陽(yáng)性率低于癌旁正常組織，而EGFR蛋白陽(yáng)性率高于癌旁正常組織(均<0.001)。見表1。

表1 不同組織中P53及EGFR蛋白表達(dá)情況對(duì)比[n(%)]

年齡≥60歲、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期鼻咽癌患者的P53蛋白陽(yáng)性率均低于年齡<60歲、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者；而年齡≥60歲、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的EGFR蛋白陽(yáng)性率均高于年齡<60歲、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(均<0.05)。見表2、表3。

表2 P53蛋白表達(dá)情況與鼻咽癌患者的臨床特點(diǎn)關(guān)系分析[n(%)]

表3 EGFR蛋白表達(dá)情況與鼻咽癌患者的臨床特點(diǎn)關(guān)系分析[n(%)]

鼻咽癌死亡組患者的P53蛋白陽(yáng)性率低于存活組，而EGFR蛋白陽(yáng)性率高于存活組(均<0.05)。見表4。

表4 鼻咽癌患者3年生存狀況和P53、EGFR蛋白表達(dá)情況的關(guān)系分析[n(%)]

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(=-0.622，<0.001)。

3 討 論

隨著近年來人們生活方式的不斷改變以及生活環(huán)境的日益惡化，鼻咽癌的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢(shì)，由于鼻咽癌細(xì)胞增殖迅速且具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)居民生命健康安全的重大疾病之一。放療是目前臨床廣泛用以治療鼻咽癌的有效手段之一，但鼻咽癌患者預(yù)后個(gè)體差異明顯，即使臨床以及病例特點(diǎn)基本相同的鼻咽癌患者，其生存狀況亦會(huì)存在明顯差異。近年來，病理學(xué)家致力于研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)EGFR以及P53作為常見的腫瘤相關(guān)基因，可能和鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中P53蛋白陽(yáng)性率低于癌旁正常組織，而EGFR蛋白陽(yáng)性率高于癌旁正常組織。這和歐陽(yáng)清等人的研究報(bào)道相符：其在報(bào)道中指出，P53蛋白在鼻咽癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較低，而EGFR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高。因此結(jié)合本研究的結(jié)果也充分提示了在臨床工作中通過對(duì)上述兩項(xiàng)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，可能有助于鼻咽癌的臨床診斷。分析原因，P53屬于抑癌基因之一，其抑癌作用機(jī)制主要是通過阻止G1/G0期，促使細(xì)胞分裂無(wú)法進(jìn)入DNA合成期，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞的增生起到抑制作用，繼而激活轉(zhuǎn)錄抑制細(xì)胞增生的基因。一旦P53基因表達(dá)下降，會(huì)導(dǎo)致其調(diào)控細(xì)胞周期以及監(jiān)視細(xì)胞生長(zhǎng)的作用喪失，繼而引發(fā)染色體畸變或/和基因突變，最終引發(fā)腫瘤。EGFR主要是由EGFR基因所編碼的一種跨膜蛋白受體，可通過和表皮生長(zhǎng)因子結(jié)合，繼而磷酸化胞內(nèi)酪氨酸激酶，促進(jìn)一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，繼而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及轉(zhuǎn)移，發(fā)揮促癌作用。此外，本研究還提示了P53、EGFR蛋白表達(dá)和鼻咽癌患者的年齡、病情嚴(yán)重程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但和患者性別、BMI無(wú)關(guān)。究其原因，正常細(xì)胞在遭受外界致癌作用時(shí)會(huì)引起P53功能的喪失，從而促使其對(duì)細(xì)胞周期正常調(diào)控作用喪失，引起細(xì)胞的無(wú)限增生，繼而促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。EGFR則可通過和多種細(xì)胞因子相結(jié)合，繼而提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)腫瘤血管的生成，從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。此外，P53、EGFR可共同作用在鼻咽黏膜上皮，繼而影響鼻咽癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移過程。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著P53蛋白表達(dá)的下降以及EGFR蛋白的升高，鼻咽癌患者預(yù)后越差。其中主要原因可能是P53蛋白表達(dá)的下降以及EGFR蛋白的升高共同促進(jìn)了鼻咽癌的進(jìn)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移。這也充分說明了P53和EGFR的變化可以更好地幫助臨床判斷患者的病情狀況及癌灶累及情況，并及時(shí)調(diào)整相應(yīng)的治療方案，從而有助于后續(xù)治療的進(jìn)行。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者P53及EGFR蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這提示了上述兩項(xiàng)蛋白可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著相互作用，繼而共同介導(dǎo)上述過程。需要指出的是性別也可能與P53和EGFR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)有關(guān)。但本文未發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)論，原因考慮與本次研究的樣本量相對(duì)較少有關(guān)，今后可擴(kuò)大樣本量或者邀請(qǐng)其他各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行更加科學(xué)的協(xié)同性研究分析。同時(shí)，為了更加科學(xué)地治療鼻咽癌，臨床可組建多學(xué)科聯(lián)合治療(MDT)團(tuán)隊(duì)開展綜合診治，視情況綜合放療科、耳鼻喉科、腫瘤科、影像科和病理科以及醫(yī)務(wù)科等科室集思廣益，盡可能以最佳的治療為患者的預(yù)后提供堅(jiān)實(shí)的保障。另外，P53聯(lián)合EGFR蛋白診斷鼻咽癌的效能較高，考慮原因可能和兩項(xiàng)蛋白聯(lián)合檢測(cè)具有一定的協(xié)同互補(bǔ)作用有關(guān)。

綜上所述，P53在廣西北部灣地區(qū)鼻咽癌患者中存在明顯低表達(dá)，而EGFR存在明顯高表達(dá)，臨床工作中針對(duì)疑似鼻咽癌患者，可通過聯(lián)合檢測(cè)上述兩項(xiàng)蛋白表達(dá)，繼而為鼻咽癌的診斷提供參考依據(jù)，有助于治療方案的制定，從而達(dá)到改善患者預(yù)后的目的。