劉雅妮，牛紅青

(1.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院全科醫(yī)療科，廣西桂林 541001； 2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科，山西太原 030001)

痛風是一種由尿酸單鈉(MSU)晶體沉積引起的晶體相關疾病，與尿酸排泄減少或嘌呤代謝紊亂引起的高尿酸血癥直接相關。由于生活方式的改變和人口老齡化，痛風的發(fā)病率和患病率逐步升高，且呈年輕化趨勢。許多證據(jù)表明，高尿酸血癥和痛風是慢性腎病、高血壓、心腦血管疾病及糖尿病等的獨立危險因素，也是患者早期死亡的獨立危險因素。痛風治療的目的是緩解關節(jié)炎癥狀，降低血尿酸以防止急性發(fā)作和復發(fā)，并最大限度減少關節(jié)損傷和功能障礙，但目前用藥仍存在爭議。臨床實踐已證實傳統(tǒng)中草藥作為輔助治療可能有益于痛風患者。因此，進一步尋找一種安全、有效的藥物并探明其作用機制具有重要意義。黃酮類化合物廣泛存在于自然界，具有多種抗炎、抗氧化、降尿酸、抗腫瘤等藥理作用。木犀草素屬于黃酮類化合物之一，是一種重要的中藥活性成分，多以糖苷的形式存在于很多植物中。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可緩解急性痛風性關節(jié)炎大鼠的關節(jié)炎癥，但缺乏更多的機制研究。為進一步探討木犀草素治療痛風的潛在機制，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法作一詳細闡述。

1 資料與方法

從PubChem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih)中獲得木犀草素的SMILES結構式，用于靶點預測。

將木犀草素的SMILES結構導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫并以可能性(probability)>0為限制條件進行靶點篩選。分別在TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/web/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)中輸入“gout”關鍵詞搜索痛風疾病靶點，去除其他物種靶點及重復靶點后結合文獻進行篩選，最終獲得痛風疾病靶點。進一步將得到的藥物靶點與疾病靶點取交集，獲取二者的共同靶點，通過在線工具Calculate and draw custom Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，擬定為木犀草素作用于痛風的潛在靶點。

將木犀草素與痛風的共同靶點上傳至String在線平臺(https://stringdb.org/)，選用Multiple proteins工具，限定物種為人類，置信區(qū)間為大于0.4，獲得蛋白質(zhì)靶點互作拓撲網(wǎng)絡(PPI)。將結果導入Cytoscape3.9.0軟件，利用cytohubba(MCC算法)插件篩選中心節(jié)點。

利用Metascape在線平臺(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對上述化合物和疾病共同靶點進行基因本體(GO)富集分析，物種選擇H.sapiens，以<0.01為條件分別對生物過程(biological processes，BP)、細胞成分(cellular components，CC)和分子功能(molecular functions，MF)進行篩選，把得到的條目按值大小排序。同樣方法再對所有共同靶點進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，得到主要相關通路(pathway)。

分子對接能有效預測化合物與靶點結合的可能性，將木犀草素化合物與1.3中獲得的關鍵靶點蛋白進行分子對接。首先準備木犀草素配體文件，將1.2中獲取的2D結構轉換為mol2格式。準備受體文件，將潛在關鍵靶點輸入蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫(ProteinData Bank，PDB)(https://www.rcsb.org/)，下載靶蛋白的3D結構，去除配體、去除溶劑后保存為pbd格式。之后運用AutoDock4.2.6軟件，設置Grid Box為整個蛋白分子，運行AutoDock4.2.6軟件對化合物及靶點蛋白進行分子對接，得到結合能，以驗證靶點與化合物的結合活性。最后用Pymol軟件將對接結果進行可視化分析。

2 結 果

從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲得木犀草素作用靶點104個。TTD數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET分別獲得痛風疾病靶點為18個、203個、205個。取交集后共獲得木犀草素治療痛風預測靶點19個(圖1)，具體為：醛酮還原酶家族1B10(AKR1B10)、碳酸酐酶1(CA1)、甲狀腺素運載蛋白(TTR)、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、多藥耐藥蛋白1(ABCB1)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)、囊性纖維化跨膜電導調(diào)節(jié)因子(CFTR)、醛糖還原酶(AKR1B1)、醛酮還原酶家族1成員C4(AKR1C4)、CXC趨化因子受體1型(CXCR1)、多藥耐藥相關蛋白1(ABCC1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、醛酮還原酶家族1成員C3(AKR1C3)、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(XDH)、3α-羥基類固醇3-脫氫酶(AKR1C2)、二氫二醇脫氫酶(AKR1C1)、細胞色素P4501B1(CYP1B1)、ATP結合盒亞家族G成員2(ABCG2)。

圖1 木犀草素治療痛風潛在靶點韋恩圖 圖2 木犀草素治療痛風潛在靶點PPI網(wǎng)絡

將19個共同靶點上傳至String在線平臺，構建得到的蛋白互作網(wǎng)絡關系圖包括19個節(jié)點、32條邊，平均節(jié)點度3.37、局部聚類系數(shù)0.6(圖2)。使用Cytoscape的cytohubba插件篩選得到核心靶點基因共5個，分別為PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3。

將19個共同靶點上傳到Metascape平臺進行GO富集分析，結果顯示木犀草素治療痛風的潛在靶點分別被富集在烯烴化合物代謝、對脂肪酸的反應、視黃醇代謝、細胞對化學應激的反應、跨上皮轉運、花生四烯酸代謝、對有毒物質(zhì)的反應、對有機磷的反應、體液調(diào)節(jié)和細胞趨化10條生物過程(圖3)；糖醇NADP氧化還原酶活性、ABC轉運蛋白活性、血紅素結合、鐵離子結合和蛋白質(zhì)二聚化活性5條分子功能(圖4)；裂解液泡、頂端質(zhì)膜、膜面和膜筏4條細胞組分(圖5)。

圖3 木犀草素治療痛風潛在靶點GO富集(生物過程)結果

圖4 木犀草素治療痛風潛在靶點GO富集(分子功能)結果

圖5 木犀草素治療痛風潛在靶點GO富集(細胞組分)結果

在Metascape平臺繼續(xù)對木犀草素作用于痛風的預測靶點加以KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)關鍵靶點富集在7條通路上，包括卵巢類固醇合成、類固醇激素合成、ABC轉運體轉運、葉酸生物合成、化學致癌、內(nèi)吞作用和癌癥相關的通路(圖6)。

圖6 木犀草素治療痛風潛在靶點KEGG富集結果

將木犀草素的2D結構與2.2中的關鍵靶點PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3對應的蛋白結構導入AutoDock4.2.6軟件進行分子對接，對接結合能分別為-5.63、-3.97、-4.78、-5.99、-6.81。結果表明木犀草素化合物與這些靶點之間具有良好的對接活性。其中最有意義的靶點為PTGS2、ABCG2，將其對接結果進行可視化分析(圖7、圖8)。

圖7 木犀草素與PTGS2分子對接 圖8 木犀草素與ABCG2分子對接

3 討 論

目前國際上通用的痛風急性期常用藥物為秋水仙堿、非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素，降血尿酸藥物為抑制尿酸合成的別嘌呤醇或非布司他、促進尿酸排泄的苯溴馬隆或丙磺舒，以及分解尿酸的重組尿酸氧化酶。但從實際情況看，這些藥物均存在一定弊端。中醫(yī)藥治療痛風雖然有效，但藥理機制尚不清楚，從而限制其傳播。網(wǎng)絡藥理學是一種研究藥物有效性和安全性的新思路，已成為中藥研究和開發(fā)不可或缺的手段。本研究就是通過網(wǎng)絡藥理及分子對接分析木犀草素治療痛風的潛在靶點，發(fā)現(xiàn)預測核心靶點包括PTGS2、ABCG2、ABCB1、SRC、AKR1C3。其中，PTGS2、ABCG2最具臨床意義。

痛風急性發(fā)作是由于尿酸鈉晶體在關節(jié)等部位局部沉積導致的炎癥反應，這時NLRP3炎癥小體激活、白細胞介素(IL)-1β釋放，并進一步導致其他促炎細胞因子和趨化因子的級聯(lián)反應。在這一過程中，環(huán)氧合酶2(COX-2)可由單核巨噬細胞、成纖維細胞PTGS2基因迅速編碼表達，通過花生四烯酸代謝途徑參與炎癥反應，是導致痛風炎性反應和組織損傷的關鍵酶之一。而花生四烯酸的代謝產(chǎn)物主要包括前列腺素(PG)和白細胞三烯(LT)等，它們均是重要的炎癥因子，可導致發(fā)熱、疼痛、血管擴張、通透性升高及白細胞滲出等炎癥反應。現(xiàn)今最常用于緩解急性痛風炎癥、疼痛和發(fā)熱的選擇性COX-2非甾體類抗炎藥，就是通過選擇性抑制COX-2活性而發(fā)揮作用。多個實驗已表明，木犀草素能通過減少活性氧及活性氮合成、花生四烯酸代謝、NF-κB和MAPK等多種炎癥通路抑制包括COX-2在內(nèi)的炎性細胞因子表達，從而降低疾病的炎癥反應，但在痛風的研究相對較少。本研究則通過篩選核心靶點，預測木犀草素同樣能夠通過PTGS2靶點抑制COX-2的表達，從而緩解痛風急性炎癥反應。經(jīng)GO富集分析也進一步發(fā)現(xiàn)木犀草素治療痛風的主要生物過程包含花生四烯酸(AA)代謝過程。

痛風發(fā)病與ABCG2基因多態(tài)性有關。其編碼蛋白屬于ABC(ATP結合盒)轉運超家族并具有穿過膜輸送多種底物的能力，是尿酸排出轉運蛋白的一種，不僅在腎近端小管細胞的頂端刷狀緣膜表達，也在腸上皮細胞中高度表達，在腎臟和腎外尿酸排泄中發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ABCG2在腸道尿酸排泄和高尿酸血癥的發(fā)病機制中起著尤為重要的作用。LIU等更是指出，血尿酸水平之所以存在性別差異是因為雌二醇可以促進腸道ABCG2的表達，從而促進尿酸排泄。很多黃酮類化合物即是通過抑制黃嘌呤氧化酶、促進ABCG2基因表達等方式發(fā)揮降血尿酸作用。其他很多類型ABC跨膜轉運蛋白在人體也廣泛分布，ABCB1編碼的蛋白就是該超家族的成員之一，可通過細胞外膜和細胞內(nèi)膜轉運藥物等各種分子，負責細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。本研究預測木犀草素能夠通過作用于ABCG2、ABCB1靶點治療痛風，由此推測其還可通過降低尿酸等發(fā)揮抗痛風作用。而且，經(jīng)GO富集分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)主要分子功能和關鍵信號通路均包含ABC轉運體及卵巢類固醇合成途徑。

另外，痛風時破骨細胞的分化和活化均明顯增強。SRC編碼的原癌基因酪氨酸蛋白激酶則能夠與PTK2B/PYK2一起在破骨細胞骨吸收中發(fā)揮重要作用，還可通過激活線粒體細胞色素C氧化酶促進破骨細胞的能量產(chǎn)生。木犀草素通過作用于該靶點，則可能發(fā)揮抑制痛風骨破壞的作用。AKR1C3編碼醛酮還原酶1C3，該酶不僅參與體內(nèi)類固醇激素的代謝，還可通過還原前列腺素D2為11β-前列腺素F2參與炎癥反應。木犀草素等黃酮類化合物均對AKR1C3存在抑制作用，可見它還可以通過該途徑抑制痛風炎癥反應。

本研究最后還對木犀草素與上述核心靶點進行了分子對接，發(fā)現(xiàn)均有較好的結合活性，進一步證實了木犀草素可通過這些靶點發(fā)揮治療痛風的作用。其中，作用于PTGS2及AKR1C3靶點可能通過花生四烯酸代謝通路抑制痛風急性發(fā)作時的炎癥反應；作用于ABCG2及ABCB1靶點則可能通過ABC轉運體通路增加尿酸的排泄；作用于SRC靶點則參與痛風破骨細胞的功能調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡藥理學工具，系統(tǒng)闡釋了木犀草素治療痛風的作用機制，并利用分子對接方法初步驗證了木犀草素化合物與其治療痛風潛在關鍵靶點發(fā)生相互作用的分子基礎。雖然，網(wǎng)絡藥理學作為一種研究中藥機制的新工具，可以幫助我們快速、有效地找到藥物治療疾病的靶點，能夠在一定程度上減少篩選實驗，有利于節(jié)約成本，但它主要依賴于現(xiàn)有的生物信息數(shù)據(jù)及計算機模擬算法，故無法預測木犀草素其他潛在的抗痛風作用，而且相應結果缺乏體內(nèi)和體外的實驗室依據(jù)，仍舊存在一定的研究局限性。因此，下一步可以考慮進行上述靶點相關的實驗室研究為木犀草素治療痛風提供更多的科學依據(jù)。