程 瑜 胡 建 劉 強 楊晉煒 王 鉅 辛東帥 郝 寧

(1.江蘇省有色金屬華東地質勘查局地球化學勘查與海洋地質調查研究院,江蘇 南京 210007;2.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院,江蘇 南京 210000)

在我國部分有色金屬礦區(qū),因早期無序開發(fā)導致礦區(qū)土壤及周邊耕地受到不同程度的重金屬污染,從而嚴重影響礦區(qū)的生態(tài)安全。研究表明,重金屬離子可通過多種途徑進入土壤,并通過作物的食物鏈循環(huán)進入人體,進而危害人體健康[1]。目前,修復重金屬污染土壤的方法主要有物理化學法和生物法:物理化學法可有效去除土壤中的重金屬,但存在成本高、易破壞土壤結構及造成二次污染等問題;生物法因土壤微生物綠色無害且能夠有效地固化重金屬從而成為一種有著廣闊應用前景的土壤修復方法[2-3]。近年來,國內(nèi)外開展了大量關于微生物固化及礦化修復土壤的機理研究。李馳等[4]研究發(fā)現(xiàn),利用微生物礦化技術可使分散性土壤變得密實緊結從而解決土壤過于分散難以種植等問題;滕應等[5]總結發(fā)現(xiàn)硫還原菌可通過自身呼吸作用將硫酸鹽還原成硫化物,還可以在同化作用過程中利用硫酸鹽合成氨基酸,如胱氨酸和蛋氨酸,再通過脫硫作用使S2-分泌于體外,并與重金屬形成硫化物沉淀從而達到礦化重金屬的目的;FUJITA、劉睿等[6-8]基于生物礦化原理,利用細菌分解尿素等底物產(chǎn)生CO32-,使重金屬離子礦化從而達到修復污染土壤的目的。

本研究利用從福建某鉛鋅礦區(qū)周邊土壤中篩選出的優(yōu)勢礦化菌種—糞產(chǎn)堿桿菌[9-11],針對配制的不同濃度的Pb2+、Cd2+和Zn2+溶液,在實驗室條件下進行尿素濃度、礦化時間、溶液pH值對重金屬離子礦化效果影響的研究,從而確定最優(yōu)的礦化條件和最佳微生物,并將該微生物用于實際土壤進行礦化效果驗證,為后期礦區(qū)土壤治理提供依據(jù)。

1 菌種采集與分析

試驗所用礦化菌種來自礦區(qū)內(nèi)有機質含量高的農(nóng)田、菜地等位置的土壤中,通過細菌富集與分離、純化、鑒定、BLAST比對分析后得到8種可能的礦化菌種,分別與糞產(chǎn)堿桿菌1、糞產(chǎn)堿桿菌2、奇異變形桿菌1、奇異變形桿菌2、普通變形桿菌1、普通變形桿菌2、溶藻弧菌1、溶藻弧菌2的同源性分別達到98.7%、97.5%、96.8%、98.9%、97.8%、99.2%、97.8%、98.2%。 8種菌分別用編號 BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2 表示,其形態(tài)見圖1所示,培養(yǎng)基配方如表1。

圖1 8種礦化細菌形態(tài)圖Fig.1 Morphology of eight mineralized bacteria

表1 微生物培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of microbial medium

2 試驗原理及試驗方法

2.1 試驗原理

碳酸鹽礦化細菌在其生長繁殖過程中產(chǎn)生特定脲酶(脲酶,系統(tǒng)命名為酰胺水解酶,是人類首次獲得晶體并發(fā)現(xiàn)含有鎳離子的金屬酶),脲酶可以催化產(chǎn)生CO32-來固結土壤中 Pb2+、Cd2+、Zn2+等重金屬離子,使其由離子可遷移態(tài)轉變?yōu)檩^穩(wěn)定的碳酸鹽礦化態(tài),從而達到礦化的目的。重金屬離子礦化過程可用如下方程式近似表示:

2.2 試驗方法

2.2.1 微生物菌種培養(yǎng)、脲酶活度測定

將從礦區(qū)分離得到的 BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2菌株在特定條件下培養(yǎng)后,取少量菌液用分光光度計測定其光密度值(optical density,簡寫為OD),以確定培養(yǎng)的菌液濃度。將培養(yǎng)的菌液離心后棄上清液,按提取比例加入提取液,超聲破碎細胞4℃條件下離心棄上清液,置冰上待測。將菌液加入試劑盒中行酶促反應并測量其吸光度值A用以測量氨量,并使用標準條件下測定的回歸方程y=0.091 5x+0.037 3,測定菌液濃度計算細菌酶活性,其中x為標準品濃度(μg/mL),y為吸光值A,最后以UE表示酶活力,單位的定義為每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1μg NH3-N,定義為一個酶活力單位。

2.2.2 細菌礦化影響因素試驗

通過細菌脲酶活度檢測,選定兩種活度最高的細菌進行試驗研究。首先在實驗室條件下進行單一重金屬離子礦化試驗,將不同類型重金屬離子溶液分別在不同尿素濃度、重金屬離子濃度、重金屬離子的加入時間、礦化反應時間時進行礦化反應,從而確定2種細菌在進行礦化反應時最佳的條件,并在此基礎上進行混合重金屬離子試驗,以此篩選出該礦區(qū)最優(yōu)的礦化菌種。

2.2.3 原土與田間試驗

利用確定的最優(yōu)礦化菌種進行原土試驗,通過考察重金屬離子礦化效果找出原土試驗與溶液試驗之間的差距,并為最終在田間進行試驗提供依據(jù)。

3 試驗結果與討論

3.1 礦化微生物菌種選定

選用0.5%的標準葡萄糖乳糖肉湯(LB)培養(yǎng)基,在自然 pH 值條件下,將得到的 BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2 菌株按照每 100 mL培養(yǎng)基接種純菌株1環(huán),在37℃恒溫培養(yǎng)箱中以170 r/min培養(yǎng)24 h,待培養(yǎng)基渾濁取出菌液。取3 mL細菌液于1 cm內(nèi)徑比色皿,利用細菌液中細胞濃度與其渾濁度成正比,與透光度成反比,用分光光度計測定其OD值表示相應菌液濃度。標準LB培養(yǎng)基配方組成為:蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%。

礦化細菌脲酶活度測定方法為將培養(yǎng)后細菌收集,離心后棄上清液,按提取比例加入提取液,超聲破碎細胞(冰浴,功率200 W,超聲3 s,間隔10 s,重復30次)4℃條件下離心棄上清液,置冰上待測。測定步驟如下:①分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至578 nm,用蒸餾水將設備調零。②酶促反應:按照試劑盒加入尿素?；靹?放入37℃水浴1 h后,10 000 r/min、25℃離心10 min,取上清液。③將上清液稀釋10倍(取0.1 mL上清液,加入0.9 mL蒸餾水)。④測氨量(在微量石英比色皿96孔板中加入試劑,充分混勻),室溫放置20 min。 混勻,于578 nm處,蒸餾水調零,讀吸光值A,計算A-A,測定管-A對照管,每個測定管設置一個對照管。⑤活力計算,標準條件下測定的回歸方程為y=0.091 5x+0.037 3;x為標準品濃度(μg/mL),y為吸光值A。

應用上述方法對選取的8種細菌的脲酶活性進行檢測,測定的脲酶活性數(shù)據(jù)見表2。

表2 脲酶活性比較Table 2 Comparison of urease activity

由表2可知,BF1(糞產(chǎn)堿桿菌1)和BF2(糞產(chǎn)堿桿菌2)的脲酶活性較高,故將采用BF1和BF2作為礦化菌種進行試驗。

3.2 不同尿素濃度對礦化效果的影響

取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h的BF1和BF2的菌液各5支,每支1 mL,分別添加1 mL不同濃度的尿素溶液(20、60、100、140、180 g/L),充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,加1 mL配制好的重金屬離子溶液(Pb2+濃度1 g/L、Cd2+濃度 0.01 g/L、Zn2+濃度1 g/L)充分混勻,放置24 h后,經(jīng)離心測定上清液中離子的含量,3種重金屬離子的礦化率變化趨勢如圖2和圖3所示。

圖2 不同尿素濃度摻量下重金屬離子礦化率(BF1)Fig.2 Mineralization rates of heavy metal ions with different concentrations of urea(BF1)

圖3 不同尿素濃度摻量下重金屬離子礦化率(BF2)Fig.3 Mineralization rates of heavy metal ions with different concentrations of urea(BF2)

由圖2、圖3可知,當尿素濃度為100 g/L時,BF1和BF2對重金屬離子具有最佳的礦化效果。當尿素濃度較低時,菌株催化底物尿素產(chǎn)生的CO32-量不足,濃度過高時,尿素溶液pH值較高,抑制脲酶的活性,從而影響重金屬離子的礦化。因此,選擇尿素濃度為100 g/L。

3.3 不同重金屬離子濃度對礦化效果的影響

因重金屬離子濃度過高會對菌株產(chǎn)生毒害作用,故開展了不同重金屬離子濃度的礦化試驗。取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h的 BF1、BF2各 15支,每支1 mL,分別添加100 g/L的尿素溶液1 mL,充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,分別加入1 mL配置好的不同濃度的 Pb2+、Cd2+、Zn2+溶液,充分混勻放置24 h后,離心測上清液中重金屬離子的含量并計算礦化率,結果見圖4。

圖4 不同重金屬離子不同濃度下的礦化率Fig.4 Mineralization rates of different heavy metal ions at different concentrations

由圖4可知,當Pb2+濃度在0.01～1 g/L之間時,2種菌種礦化率隨Pb2+濃度增加均呈現(xiàn)波動提高趨勢,在試驗區(qū)間內(nèi)濃度最大時礦化率最高,其中添加BF1時礦化率最高達90.7%;當Cd2+在0.001～0.01 g/L之間時,BF1對Cd2+的礦化率在65%～69%之間,隨著離子濃度降低礦化率呈現(xiàn)上升趨勢,BF2對Cd2+的礦化率在60%～64%,礦化率隨離子濃度變化不明顯;當Zn2+濃度在0.01～1 g/L之間時,BF1對Zn2+的礦化率隨著濃度增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,最高礦化率為81.1%,BF2對Zn2+的礦化率隨離子濃度增加而增大,最高為76.8%。綜合對比上述數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),BF1和BF2兩種微生物在相應的重金屬離子濃度區(qū)間內(nèi)礦化率較為穩(wěn)定,說明上述區(qū)間內(nèi)重金屬對菌株的毒性較小,總體而言BF1對Pb2+、Cd2+和Zn2+的礦化效果要好于BF2。

3.4 脲酶催化時間對礦化效果的影響

因菌株產(chǎn)脲酶至脲酶催化底物尿素需要反應時間,為獲得脲酶催化底物尿素的最佳反應時間,進行了不同反應時間的試驗研究。取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h的BF1、BF2各5批,每批各3支,分別添加濃度為100 g/L尿素1 mL,充分振蕩混勻,在加入尿素1、2、3、4、5 h后,分別加入1mL配置好的重金屬離子溶液充分混勻,放置24 h后,離心測上清液中重金屬離子的含量并計算礦化率。脲酶催化尿素不同反應時間時重金屬離子的礦化率見圖5和圖6。

圖5 脲酶催化尿素不同反應時間重金屬離子的礦化率(BF1)Fig.5 Mineralization rates of heavy metal ions in urea catalyzed by urease at different reaction times(BF1)

圖6 脲酶催化尿素不同反應時間重金屬離子的礦化率(BF2)Fig.6 Mineralization rates of heavy metal ions in urea catalyzed by urease at different reaction times(BF2)

由圖5、圖6可知,BF1和BF2在添加尿素2 h后加入重金屬離子進行反應時礦化效果最好。加入時間過早,脲酶不能完全催化底物尿素分解為CO32-;加入時間過晚,酶易分解,進而影響脲酶催化底物尿素分解產(chǎn)生碳酸根,因而重金屬離子的最佳添加時間為加入尿素后的2 h左右。

3.5 礦化反應時間對礦化效果的影響

通過礦化反應時間對重金屬礦化率的影響試驗,得到不同礦化時間下重金屬離子的礦化率,試驗結果見圖7、圖8。 取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1、BF2的菌液各5批,每批各3只,分別添加濃度100 g/L的尿素1 mL,充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,加入1 mL配制好的重金屬離子溶液,充分混勻,放入37℃、170 r/min的搖床中,每隔12 h每種菌分別取3支,共取5次,離心分析上清液中重金屬離子的含量并計算礦化率。

圖7 不同礦化時間下重金屬離子的礦化率(BF1)Fig.7 Mineralization rates of heavy metal ions at different mineralization times(BF1)

圖8 不同礦化時間下重金屬離子的礦化率(BF2)Fig.8 Mineralization rates of heavy metal ions at different mineralization times(BF2)

由圖7、圖8可知,礦化時間越長,重金屬離子的礦化率越好,但是從48 h后,礦化率增長緩慢并趨于平緩,故最佳的礦化時間應控制在48 h左右。

3.6 混合重金屬離子礦化效果試驗

在確定了各因素對重金屬離子礦化率的影響及最佳摻量后,模擬真實土壤在溶液環(huán)境下開展混合重金屬離子礦化試驗。取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1、BF2的菌液共8支,每支1mL,分別添加濃度100 g/L的尿素1mL,充分振蕩混勻,催化底物尿素2 h后,加入1 mL配置好的混合重金屬離子溶液,充分混勻,放置24 h后,離心測上清液中重金屬離子的含量并計算礦化率,試驗結果見圖9(其中,A組試驗Pb2+濃度 0.01 g/L,Cd2+濃度 0.001 g/L,Zn2+濃度0.01 g/L;B組試驗Pb2+濃度 1 g/L,Cd2+濃度 0.01 g/L,Zn2+濃度 1 g/L;C組試驗Pb2+濃度0.04 g/L,Cd2+濃度 0.02 g/L,Zn2+濃度 0.02 g/L;D組試驗Pb2+濃度 0.1 g/L,Cd2+濃度0.01 g/L,Zn2+濃度0.1 g/L)。

圖9 混合重金屬離子礦化率Fig.9 Mineralization rates of mixed heavy metal ions

由圖9可知,用BF1、BF2進行混合重金屬離子礦化試驗時,在不同重金屬濃度配比條件下,Pb2+的礦化率大于80%,Cd2+的礦化率大于62%,Zn2+的礦化率均在77%以上。對比前述單因素條件試驗可知,混合離子的礦化效果和單元素離子試驗的礦化效果相當,由此說明BF1、BF2對混合重金屬離子的礦化效果均較為理想。在混合體系中,BF1細菌的礦化效果均好于BF2菌。

3.7 菌種pH耐受性試驗

對菌株的pH耐受性進行試驗,取37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1、BF2的菌液各5 mL,采用HCl、NaOH 調節(jié) pH 為 4、5、6、7、8、9 進行細菌的活性試驗。測得細菌的活性值見圖10。

圖10 不同pH條件下菌株的脲酶活性Fig.10 Urease activity of strains under different pH conditions

由圖10可知,BF1的脲酶活性耐受能力比BF2要強,在pH=4.0時脲酶活性最低,pH=8.0時脲酶活性最高,pH=9.0時脲酶活性略有降低,BF1最佳的pH適用范圍是pH=6～8,由此也說明在強酸或者強堿條件下,細菌活性受到抑制,對于如何使細菌在該范圍內(nèi)保持活性,正是國際和國內(nèi)攻堅克難的重點。

綜合上述試驗可知,BF1菌無論是脲酶活性還是對重金屬離子的礦化率都好于BF2菌,后續(xù)將使用BF1菌開展重金屬污染土壤的修復試驗。

3.8 實驗室土壤修復試驗

3.8.1 試驗樣品

試驗土壤樣品采自福建某鉛鋅礦區(qū),依據(jù)土壤污染狀況調查結果,挑選出污染程度不同的兩種土壤:重污染土壤(簡稱S1)、中度污染土壤(簡稱S2)。土壤樣品采取時遵循NYT 1121.1-2006《土壤檢測第1部分:土壤樣品的采集、處理和貯存》[12]去除雜物后封裝運輸,其中S1樣品30 kg、S2 樣品 20 kg。

將取回的土壤樣品按四分法,縮分至2 kg左右自然風干,研磨,過0.2 mm篩,分別保存用于分析和試驗,兩種土壤重金屬Pb、Cd、Zn總量和各形態(tài)分析結果見表3、表4,土壤形態(tài)分析采用Tesier順序提取法。

表3 S1土壤總量及各形態(tài)含量Table 3 Total and morphological contents of S1 soil mg/kg

表4 S2土壤總量及各形態(tài)含量Table 4 Total and morphological contents of S2 soil mg/kg

由表3可知,S1土壤中Pb、Cd、Zn總量高,其中Cd主要以離子態(tài)和碳酸鹽結合態(tài)形式存在,而Pb、Zn大部分以鐵錳結合態(tài)和殘渣態(tài)形式存在,以離子態(tài)存在的含量僅占總量的0.69%和0.38%。表4顯示S2土壤中Pb、Cd、Zn總量高,但離子態(tài)含量與土壤S1類似,Pb、Zn離子態(tài)含量很低,Cd離子態(tài)含量較高。依據(jù)福建省地方標準《農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染程度的分級》[13]中的農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬有效態(tài)(離子態(tài))限制值標準(Pb2+含量＜35 mg/kg、Cd2+含量＜0.3 mg/kg、Zn2+含量＜60 mg/kg)可判斷,2種土壤3種重金屬中僅有Cd2+超過限制值,會對農(nóng)產(chǎn)品造成危害。

3.8.2 結果分析

使用培養(yǎng)后的BF1菌液對試驗土壤進行礦化試驗研究。取S1、S2各20 g于小碗中(碗底平鋪四層紗布),將1.2 mL、37℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后的BF1菌液和3 mL濃度100 g/L的尿素溶液混合2 h后,加入上述土壤充分混勻,靜置48 h后,應用Tesier順序提取法分析重金屬離子的含量并與原土對比,反應后結果見圖11,結果見表5、表6。

圖11 不同土壤礦化效果Fig.11 Different soil mineralization effects

表5 S1土壤樣重金屬離子礦化效果Table 5 Mineralization effect of heavy metal ions in S1 soil samples

表6 S2土壤樣重金屬離子礦化效果Table 6 Mineralization effect of heavy metal ions in S1 soil sample

由表5、表6數(shù)據(jù)可知,在與離子溶液條件基本相同的情況下,BF1菌對S1、S2兩種土壤中 Pb2+、Zn2+礦化率均到達83%以上,Cd2+的礦化率在60%左右,且礦化后土壤中所有重金屬離子濃度均達到《農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染程度的分級》(DB35/T 859-2016)指標中的限制值標準,可作為耕地繼續(xù)使用。同時,與前述混合離子溶液試驗結果對比可知,BF1菌在真實土壤中的礦化效果略差于溶液中,其主要原因可能是土壤成分復雜,對菌株生長、細菌脲酶活性均有一定影響,可考慮向礦化菌中添加甘油作為保護劑,以阻止部分導致酶失活的物質接近活性中心,從而提高了酶的穩(wěn)定性。

3.9 田間試驗

為進一步驗證BF1菌在實際土壤環(huán)境中礦化重金屬離子的效果,在該鉛鋅礦區(qū)內(nèi)選擇一處因重金屬Cd污染而荒廢的農(nóng)田進行田間試驗,田塊面積約800 m2,翻耕深度300 mm,將600 L OD=7的高濃度BF1菌液,在-4℃條件下運至礦區(qū)試驗田進行試驗。先加尿素底物稀釋10倍后,分多次均勻噴灑在田內(nèi),每次噴灑后翻動并混合土壤,噴灑完成后覆蓋薄膜72 h同時保持土壤濕度80%以上,在不同時間段檢測微生物礦化后土壤中重金屬離子變化情況,結果見表7。

表7 田間試驗重金屬Cd2+離子礦化效果Table 7 Field experiment on mineralization effect of heavy metal Cd2+ion

由表7可知,在自然條件下的田間試驗中,未礦化前Cd2+超過《農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤重金屬污染程度的分級》(DB35/T 859-2016)中限制值標準,屬于限制使用的農(nóng)用地,礦化修復后Cd2+小于限制值標準,屬于可利用農(nóng)用地;同時土壤中Cd2+在微生物礦化處理后1年內(nèi)變化不明顯,說明使用該微生物進行礦化修復后可在一定時期內(nèi)使重金屬離子濃度保持穩(wěn)定。

4 結 論

(1)試驗菌取自福建某鉛鋅礦區(qū)內(nèi)有機質含量高的農(nóng)田、菜地、小樹林等土壤中,篩選分離得到BF1、BF2、BQ1、BQ2、BP1、BP2、BR1、BR2 共8 種可產(chǎn)生脲酶的礦化菌種,選取活性較高的BF1、BF2進行試驗。最終試驗的土壤樣品S1、S2取自礦區(qū)特定區(qū)域。

(2)研究發(fā)現(xiàn)在重金屬離子濃度區(qū)間為Pb2+0.01～1 g/L,Cd2+0.001～0.01 g/L,Zn2+0.01～1 g/L時,對BF1、BF2菌株生長基本沒有影響。

(3)在上述重金屬離子濃度區(qū)間內(nèi),細菌礦化重金屬離子的最佳試驗條件為尿素濃度100 g/L、加尿素反應2 h后加入重金屬離子溶液、礦化時間48 h以上且pH范圍6-8。通過混合重金屬離子礦化試驗,表明 BF1、BF2 對 Pb2+、Cd2+、Zn2+的礦化率在 80%、62%、77%以上,且BF1 細菌對Pb2+、Cd2+、Zn2+的礦化效果均好于BF2菌。

(4)通過實際土壤修復試驗發(fā)現(xiàn),BF1菌對S1、S2兩種土壤中Pb2+、Zn2+的礦化率均到達83%以上,Cd2+的礦化率在60%左右。真實土壤中重金屬離子礦化效果與溶液中試驗結果相比要差,其主要原因可能是土壤成分復雜,導致菌株生長和酶活性受到影響。田間試驗結果顯示,使用BF1菌修復鎘污染農(nóng)田,一年后礦化效果依舊理想。

(5)試驗所選取的BF1、BF2菌種,在生長繁殖過程作用下產(chǎn)生酶,通過酶的催化作用分解尿素產(chǎn)生碳酸根并與重金屬離子結合形成碳酸鹽沉淀。這種生物礦物修復重金屬污染土壤方法工藝簡單,實用價值高,環(huán)境友好,具有大面積推廣使用的可能性。