李潔，翟克超，劉永達，袁繼行

海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，上海 200433

正常的肝臟主要包括肝細胞、肝血竇內(nèi)皮細胞、Kupffer 細胞以及肝星狀細胞等［1］。Kupffer 細胞是肝臟特有的巨噬細胞，也是體內(nèi)最大的常駐組織巨噬細胞群，其通過吞噬作用和抗原提呈作用在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能［2-3］。在肝臟發(fā)生病變時，Kupffer 細胞的功能也相應(yīng)發(fā)生改變，甚至發(fā)揮截然相反的作用。因此，進一步揭示Kupffer 細胞在肝臟穩(wěn)態(tài)的維持以及疾病中的作用具有重要意義，而體外高效獲取Kupffer 細胞有助于研究的開展。小鼠Kupffer 細胞分離純化最常用的方式是膠原酶原位肝臟灌注消化肝組織，并利用Percoll 進行密度梯度分離獲取肝臟非實質(zhì)細胞（NPC），使用貼壁法或免疫細胞磁珠分選（MACS）或流式細胞分選（FACS）獲取最終的Kupffer 細胞［4-6］。膠原酶Ⅳ對細胞損傷較小，適合進行肝臟細胞提取。但預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)膠原酶Ⅳ消化過長時間會影響NPC 細胞總活率及Kupffer 細胞分選得率，而且影響了Kupffer 對腫瘤細胞的吞噬活性。Kupffer 細胞可以通過吞噬作用清除一部分隨外周血轉(zhuǎn)移到肝血竇內(nèi)的腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞向肝臟轉(zhuǎn)移的過程。我們提取肝臟原代Kupffer 細胞也正是為體外吞噬腫瘤細胞的實驗做準備，所以分離獲取較好吞噬活性的Kupffer 細胞非常重要。故本研究用不同消化時間的0.04%膠原酶Ⅳ進行肝臟原位灌注及肝臟組織消化，并在體外共培養(yǎng)Kupffer 細胞與腫瘤細胞，觀察膠原酶Ⅳ消化時間對Kupffer 細胞肝臟原位灌注結(jié)合MACS 提取效果及吞噬腫瘤細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞系 實驗動物：雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，無特定病原體級，常規(guī)飼養(yǎng)，購買自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗用細胞系：小鼠黑色素瘤細胞系B16F10，購于中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器 50 mL 離心管、15 mL 離心管、24 孔超低吸附平板購于美國Corning 公司；Hank"s 平衡鹽溶液（HBSS，含鈣鎂和不含鈣鎂）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海源培生物；98%三溴乙醇購于上海麥克林生化科技有限公司；臺盼藍購于上海生工；Percoll 購自美國GE Healthcare 公司；膠原酶Ⅳ購于美國Worthington 公司；小鼠抗-F4/80 超純磁珠（Anti-F4/80 MicroBeads UltraPure，mouse）、磁珠分選柱（MS/LS Columns）購自德國Miltenyi Biotec 公司。細胞增殖示蹤熒光探針CFSE（CFDA-SE）購自上海翊圣生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、青霉素—鏈霉素、0.25%Trypsin-EDTA、DMEM 培養(yǎng)基、IMDM 培養(yǎng)基購于美國Thermo Fisher Scientific公司。胰島素注射器、留置針、100μm/70μm濾膜、APC 或者Alexa flour 647 標記的anti-F4/80 抗體、PE標記的anti-CD11b 抗體購買自美國BD Bioscience公司。

1.3 不同膠原酶Ⅳ消化時間下Kupffer 細胞肝臟原位灌注結(jié)合免疫磁珠分選提取效果觀察

1.3.1 肝原位灌注法獲取NPC 細胞及總活率計算 取1 只小鼠，腹腔注射三溴乙醇（1.2%，0.2 mL/10 g 體質(zhì)量）麻醉，棉棒和碘伏擦拭小鼠腹部后，用滅菌的手術(shù)剪和鑷子將小鼠腹部皮膚縱向剪開（注意禁止剪破腹膜），棉棒和碘伏擦拭腹部內(nèi)皮表面，換新剪刀鑷子將其腹部內(nèi)皮剖開。用棉棒將小鼠其他內(nèi)臟器官撥到右側(cè)（防止剪破小腸和胃污染細胞），充分暴露門靜脈和下腔靜脈，用無菌鑷子小心分離門靜脈周圍組織，保證門靜脈完整不破裂，用鑷子輕輕挑起支撐。留置針插入肝門靜脈后，剪刀剪開下腔靜脈。用37 ℃預(yù)熱的不含鈣鎂的HBSS 沖洗肝臟10 min，流速20 r/min（蠕動泵），直至肝臟由暗紅色變成土黃色且下腔靜脈中無血液流出。用含鈣鎂的HBSS（含0.04%膠原酶Ⅳ）灌注10 min，流速15 r/min，期間間斷性用鑷子夾緊下腔靜脈。將肝臟完全剝離，去除膽囊，用不含鈣鎂的HBSS 沖洗，置于6 cm 細胞培養(yǎng)皿中，加入2～3 mL 含鈣鎂的HBSS（含0.04%膠原酶Ⅳ），保證浸泡肝臟，將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中進行不同時間的消化（5、10、20 min），分別計為5 min 消化組、10 min 消化組、20 min 消化組，每組分別取6 只小鼠肝臟。用鑷子輕輕抖動肝臟，1 mL 槍頭輕輕吹散，用100 μm 濾膜過濾至50 mL 離心管中，所獲得細胞即為肝臟細胞懸液。將肝臟細胞懸液用不含鈣鎂的HBSS補齊50 mL，4 ℃預(yù)冷離心機，40×g，3 min，收集上清。沉淀用50 mL 不含鈣鎂的HBSS 重懸，4 ℃，30×g，3 min，收集上清。將兩次收集的上清離心，4 ℃，650×g，7 min 后收集沉淀，用4 mL 不含鈣鎂的HBSS 重懸細胞，70 μm 濾膜過濾，4 ℃暫放。先配 置100%Percoll（10% 10×PBS + 90% Percoll 原液），繼 續(xù) 用1×PBS 分 別 稀 釋 成50%Percoll 和25%Percoll。沿15 mL 離心管內(nèi)壁緩慢依次加入5 mL 50%Percoll、5 mL 25%Percoll 和4 mL 細 胞 懸液，4 ℃，1 800×g，15 min 離心。離心結(jié)束后，取中間層細胞懸液（離心管刻度3～8 mL）至50 mL 離心管中，補加HBSS 至50 mL，4 ℃，650 g，7 min 離心后收集沉淀，即為肝臟NPC。用5 mL HBSS 重懸NPC，取10 μL NPC 細胞懸液與10 μL 臺盼藍充分混勻后，加入計數(shù)板，用Countstar 智能細胞分析儀進行活細胞計數(shù)及細胞活率計算。

1.3.2 MACS 分選獲取Kupffer 細胞及Kupffer 細胞占NPC 比例計算 根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果，按照每107細胞用90 μL 磁珠分選緩沖液重懸，并加入10 μL anti-F4/80的磁珠，4 ℃避光孵育15 min。107總細胞中加入1～2 mL 的4 ℃磁珠分選緩沖液，輕輕吹勻，4 ℃，300×g 離心10 min，棄上清。用磁珠分選緩沖液重懸細胞，使其達到每500μL 含有108總細胞，準備過MS/LS 柱。嚴格按照產(chǎn)品說明書操作，將MS/LS 柱放于磁力架上，并用磁珠分選緩沖液潤洗（防止氣泡的產(chǎn)生），將已經(jīng)孵育完抗體磁珠的細胞懸液加入MS/LS 柱中，待其全部流出后，用磁珠分選緩沖液洗滌MS/LS柱3遍。將MS/LS柱從磁力架上取下，加入磁珠分選緩沖液（MS 柱：1 mL，LS 柱：5 mL），用助推器快速推動液體流穿，并收集流穿液于15 mL 離心管中，即為Kupffer 細胞。取10 μL Kupffer 細胞懸液與10 μL 臺盼藍充分混勻后，加入計數(shù)板，用Countstar 智能細胞分析儀進行活細胞計數(shù)，將Kupffer 活細胞數(shù)除以NPC 活細胞總數(shù)，得到MACS分選后Kupffer細胞占比。

1.3.3 Kupffer 細胞形態(tài)學(xué)分析 將MACS 分選所得Kupffer 細胞用相同體積的培養(yǎng)基重懸，取相同體積的細胞懸液鋪于培養(yǎng)皿中，待其貼壁1 h 后，觀察在光學(xué)顯微鏡下觀察Kupffer細胞形態(tài)和密度。

1.3.4 MACS 分選Kupffer 細胞得率分析 將肝臟NPC 細 胞 用PBS 清 洗1 次，取1×106細 胞 重 懸 于100 μL FACS 緩沖液（2%FBS 的PBS 溶液），按照1∶100 的稀釋比例加入Fc-blocker，冰上30 min 封閉；按照1∶100 的稀釋比例加入流式抗體（APC 標記的anti-F4/80 抗體、PE 標記的anti-CD11b 抗體），冰上避光20 min 染色；每管細胞用500 μL PBS 洗滌兩遍，ThermoFisher Attune NxT 流式細胞儀檢測。用MACS 獲得的Kupffer 細胞占NPC 比例除以流式細胞術(shù)分析所得Kupffer 細胞占NPC 比例計算Kupffer細胞得率。

1.4 不同膠原酶Ⅳ消化時間下Kupffer 細胞吞噬腫瘤細胞功能作用觀察 膠原酶Ⅳ消化時間對Kupffer 細胞吞噬腫瘤細胞的功能影響觀察B16F10培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)基（其中補充10%FBS和1%的青霉素—鏈霉素）中；Kupffer細胞培養(yǎng)于IMDM 培養(yǎng)基（其中補充10%FBS 和1%的青霉素—鏈霉素）中。所有細胞均培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。用CFSE 標記B16F10 細胞，并充分清洗細胞，按照B16F10 細胞與MACS 分選得到的Kupffer 細胞4∶1的比例混合培養(yǎng)2 h。孵育結(jié)束后收集細胞，用Alexa Flour 647 標記的anti-F4/80 流式抗體染色，進行流式細胞術(shù)分析。通過計算CFSE 陽性（CFSE+）的Kupffer細胞占所有Kupffer細胞的比例，計算吞噬比例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NPC 總活率比較 肝臟灌注消化后小鼠肝臟組織變得柔軟，用鑷子輕輕抖動肝臟即可看到組織塊脫落并呈現(xiàn)云霧狀，且消化時間越長，脫落組織塊越細小，云霧狀越明顯（詳圖1）。5 min消化組、10 min 消 化 組、20 min 消 化 組NPC 活 率 分 別 為75.070%±1.886%、53.570%±2.257%、30.250%±3.466%，5 min 消化組分別與10 min 消化組、20 min消化組比較，P均＜0.05。

圖1 膠原酶Ⅳ消化后各組肝臟組織脫落及分散情況

2.2 各組Kupffer 細胞、NPC 細胞總數(shù)及Kupffer 細胞占NPC 細胞比例 Kupffer 細胞、NPC 細胞總數(shù)及Kupffer細胞占NPC細胞比例見表1。

表1 各組Kupffer細胞、NPC細胞總數(shù)及Kupffer細胞占NPC細胞比例（±s）

表1 各組Kupffer細胞、NPC細胞總數(shù)及Kupffer細胞占NPC細胞比例（±s）

注：與其余兩組比較，*P＜0.05。

組別5 min消化組10 min消化組20 min消化組Kupffer細胞總數(shù)（105）6.92±1.40*2.85±0.37 0.82±0.07 NPC細胞總數(shù)（106）4.39±1.13 4.50±0.73 4.06±0.62 Kupffer細胞比例（%）15.94±0.93*6.36±0.25 2.05±0.34

2.3 各組Kupffer細胞形態(tài)學(xué)比較 Kupffer細胞完全貼壁后呈現(xiàn)扁平不規(guī)則外形，折光度較低；未完全貼壁的Kupffer細胞多呈現(xiàn)圓形或者棘狀，折光度較高。相對于10 min消化組和20 min消化組，5 min消化組細胞密度最大，且完全貼壁細胞最多（詳見圖2）。

圖2 不同消化時間MACS分選得Kupffer的形態(tài)（相差顯微鏡，×400）

2.4 各組MACS-Kupffer細胞比例、FACS-Kupffer細胞比例、Kupffer 細胞得率比較 MACS-Kupffer 細胞比例、FACS-Kupffer細胞比例、Kupffer細胞得率比較見表2。

表2 組MACS-Kupffer細胞比例、FACS-Kupffer細胞比例、Kupffer細胞得率比較（±s）

表2 組MACS-Kupffer細胞比例、FACS-Kupffer細胞比例、Kupffer細胞得率比較（±s）

注：與其余兩組比較，*P＜0.05。

組別5 min消化組10 min消化組20 min消化組MACS-Kupffer細胞比例（%）15.94±0.93 6.36±0.25 2.05±0.34 FACS-Kupffer細胞比例（%）18.37±0.67*11.47±1.06 4.55±0.48 Kupffer細胞得率（%）86.79±5.05*55.46±2.19 45.14±7.50

2.5 各組Kupffer 細胞吞噬比例比較 5 min 消化組、10 min消化組、20 min消化組Kupffer細胞吞噬比例 分 別 為27.970 0% ± 0.959 7%、21.830 0% ±0.589 7%、17.230 0% ± 0.693 6%，5 min 消化組分別與10 min消化組、20 min消化組比較，P均＜0.05。

3 討論

研究［3，7］顯示，Kupffer 細胞在炎癥反應(yīng)、腫瘤免疫、肝臟穩(wěn)態(tài)的維持等方面發(fā)揮重要功能。在藥物引起的肝損傷及毒素誘導(dǎo)的纖維化過程中，Kupffer細胞具有保護性作用［8-9］。但是，Kupffer 細胞調(diào)控的炎性失調(diào)也會導(dǎo)致慢性炎癥的產(chǎn)生［10］。此外，Kupffer 細胞在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮復(fù)雜的甚至截然相反的功能，這取決于一些特定的因素，例如轉(zhuǎn)移的階段、腫瘤抗原載量、與其他免疫細胞的相互作用等［11］。所以，對于Kupffer 細胞功能及機制的研究非常重要，而Kupffer 細胞提取對于其作用機制的研究十分重要，如何在體外進行高效的Kupffer 細胞分離提取也就變得尤為重要。

獲取Kupffer 細胞的第一步是對肝臟組織進行有效的消化，并獲取高質(zhì)量的肝臟NPC。目前，對肝組織進行消化較為有效的方法主要包括灌注膠原酶Ⅳ消化法（包括原位灌注和離體灌注）和利用德國美天旎的單細胞制備系統(tǒng)，后者需要專門的儀器設(shè)備，且試劑盒價格較高［6］。小鼠的Kupffer細胞表面有巨噬細胞通用的表面分子F4/80，目前利用MACS方法獲取小鼠Kupffer細胞主要依賴于anti-F4/80的單克隆抗體。MACS 技術(shù)是1990 年報道的，起初它主要應(yīng)用于研究血細胞的祖細胞，現(xiàn)在應(yīng)用頗為廣泛［12-13］。相對于FACS 來說，雖然在純度和得率方面MACS 稍顯遜色，但是它更加高效簡捷，適合實驗室大量快捷的獲取Kupffer 細胞，尤其適合研究體外原代培養(yǎng)時Kupffer 細胞在相關(guān)疾病中的機制。所以，本研究通過摸索膠原酶Ⅳ原位灌注小鼠肝臟的最佳條件，解析膠原酶Ⅳ消化時間對通過MACS 獲取Kupffer 細胞及其吞噬功能的影響。有文獻報道，膠原酶的過度消化可以降低肝臟NPC 細胞活性，而膠原酶消化時間較低時影響NPC 細胞總量，從而影響大鼠的門靜脈成纖維細胞的提取效果［13］。我們在小鼠Kupffer 細胞提取過程中發(fā)現(xiàn)，過度的膠原酶Ⅳ消化，顯著降低了NPC 細胞活率和通過MACS 分選得到的Kupffer 細胞的總數(shù)及比例，但對于所獲得的NPC 活細胞總數(shù)影響不大。由此可推測Kupffer 細胞對膠原酶Ⅳ更加敏感，對于Kupffer 細胞的提取需控制膠原酶Ⅳ消化時間。通過對比肝血竇內(nèi)皮細胞與Kupffer 細胞對膠原酶Ⅳ的敏感程度，我們也發(fā)現(xiàn)，LSEC更能夠耐受較高強度的膠原酶Ⅳ消化。一般情況下，MACS分選細胞得率在60%～90%。本文結(jié)果顯示，MACS 分選的細胞得率與NPC 中Kupffer細胞占比有相關(guān)性，NPC 中Kupffer 細胞比例越高，則通過MACS 分選獲得的Kupffer 細胞得率也就越高，這可能與Kupffer 細胞的抗原完整性和活性有關(guān)。

Kupffer 細胞具有吞噬活性及抗原提呈功能，此外也可以分泌一系列細胞因子參與炎癥和腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，例如IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-β［14-18］。Kupffer 細胞的吞噬作用十分強大，他們可以吞噬病原體、免疫復(fù)合物、脂質(zhì)體、脂質(zhì)微球、腫瘤細胞、內(nèi)毒素和其他顆粒等。體外進行巨噬細胞（例如Kupffer 細胞）與腫瘤細胞共培養(yǎng)研究巨噬細胞吞噬作用是研究人員常用的方法［19-21］。本研究通過體外共培養(yǎng)Kupffer 細胞和腫瘤細胞，評估膠原酶Ⅳ消化不同時間對Kupffer 細胞吞噬作用的影響，結(jié)果顯示過度的膠原酶Ⅳ消化不僅影響Kupffer細胞得率也會影響Kupffer細胞的吞噬活性。這可能與膠原酶對Kupffer 細胞表面吞噬相關(guān)膜受體蛋白造成的損傷有關(guān)。文獻［22］報道，一種Ⅳ型膠原酶可破壞肺泡基底膜。

總之，適當?shù)哪z原酶Ⅳ消化時間對Kupffer 細胞肝臟原位灌注結(jié)合MACS 提取是有利的，而且也更有助于Kupffer細胞對腫瘤細胞的吞噬作用。