袁金，康佳麗，王小霞

華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510180

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的失活以及異常細(xì)胞信號(hào)通路的激活有關(guān)［1-6］。大多數(shù)卵巢癌患者易復(fù)發(fā)，對(duì)化療有耐藥性，鉑類耐藥患者預(yù)后差，對(duì)進(jìn)一步化療的反應(yīng)率低，且中位生存期低于12 個(gè)月［7］。本課題組前期研究將可特異結(jié)合卵巢癌細(xì)胞的短肽［8］與廣譜的細(xì)胞穿膜肽、可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的絲裂原活化蛋白激酶激酶6 的組成性突變體重組，構(gòu)建成靶向融合肽（MAP2K6-FP）［9］。前期研究表明，MAP2K6-FP 能在體外水平增加耐藥性卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑（DDP）的敏感性。本實(shí)驗(yàn)擬從體內(nèi)水平研究MAP2K6-FP 對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞的生長抑制作用。本研究以裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，腹腔注射人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株（SKOV3/DDP）制備順鉑耐藥卵巢癌移植瘤模型，注射1 周后尾靜脈注射0.25 mg/kg的MAP2K6-FP，觀察MAP2K6-FP 對(duì)裸鼠順鉑耐藥卵巢癌移植瘤生長的抑制作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 MAP2K6-FP及SKOV3/DDP細(xì)胞 MAP2K6-FP為本課題組前期通過原核表達(dá)的方法成功構(gòu)建，保存于-20 ℃環(huán)境中。SKOV3/DDP 細(xì)胞購于北京市腫瘤醫(yī)院。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2培 養(yǎng)箱中。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性BALB/C nu/nu 裸鼠14 只，4～6 周齡，體質(zhì)量（14 ± 0.96）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（粵）2008-0002］，在廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［YXK（粵）2010-0104］進(jìn)行SPF 級(jí)飼養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：440072000，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明編號(hào)：00066334）。斑馬魚受華中科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院惠贈(zèng)，并以自然成對(duì)交配的方式在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行繁殖。依照國際AAALAC 的要求，其飼養(yǎng)條件為28 ℃，pH 值6.9～7.2，硬度53.7～71.7 mg/L CaCO3 的養(yǎng)魚用水（200 mg 速溶海鹽加入1 L 反滲透水以維持為480～510 μS/cm電導(dǎo)率）。

1.3 主要試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶-EDTA（0.25%∶0.2%）購自美國Sigma 公司；多克隆兔抗人VEGFR-3、LYVE-1、EGFR3 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗人D2-40及β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京博奧森生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和SP 試劑盒購自北京碧云天生物有限公司。

1.4 裸鼠順鉑耐藥卵巢癌模型制備、MAP2K6-FP注射方法及移植瘤、淋巴管相關(guān)指標(biāo)觀察 ①裸鼠順鉑耐藥卵巢癌模型制備、MAP2K6-FP 注射方法：SKOV3/DDP 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用PBS 洗3次，然后用生理鹽水稀釋細(xì)胞懸液。每只裸鼠腹腔 內(nèi) 注 射 200 μL 的 SKOV3/DDP 細(xì) 胞（5×106/mL）。腹腔內(nèi)注射SKOV3/DDP 細(xì)胞1 周后，將制模成功的裸鼠隨機(jī)分為兩組（各7 只）。觀察1 組尾靜脈注射0.25 mg/kg 的MAP2K6-FP，每周2 次；對(duì)照1 組尾靜脈注射5 mL/kg 的生理鹽水，每周2次；共注射4 周。②裸鼠腹圍測量及腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量記錄：每周測量3 次裸鼠腹圍。治療1 個(gè)月后（腹腔注射細(xì)胞后5 周），統(tǒng)一處死全部裸鼠，解剖并記錄裸鼠腹水量、腫瘤播散器官數(shù)（如大網(wǎng)膜、腸系膜、腹壁、橫膈、肝、脾、肺和腎等有腫瘤生長的部位）和瘤結(jié)節(jié)數(shù)量（腹腔可見數(shù)個(gè)米粒至豌豆大小的瘤體）。剝離出移植瘤（腫瘤結(jié)節(jié)及裸鼠肝、脾、腎、肺等主要臟器），石蠟包埋，用作后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。③裸鼠移植瘤中血管內(nèi)皮生長因子特異性受體3（VEGFR-3）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）、唾液酸糖蛋白（D2-40）及表皮生長因子受體3（EGFR3）檢測：a.VEGFR-3、LYVE-1、D2-40：采用免疫組化SP 法。以PBS 緩沖液作為陰性對(duì)照，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。在400 倍光學(xué)顯微鏡視野下，每100 個(gè)腫瘤細(xì)胞中胞質(zhì)及胞膜呈棕黃染色的細(xì)胞比例＜10%為陰性，≥10%為陽性。腫瘤組織中VEGFR-3、LYVE-1、D2-40 的平均灰度值由圖像分析系統(tǒng)全自動(dòng)測定。VEGFR-3、LYVE-1以陽性率表示（棕黃色顆粒占比），D2-40 以個(gè)/視野表示。b.EGFR3：采用蛋白印跡法。取移植瘤組織，用RIPA 裂解液裂解并提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。取30μg 進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。繼之在4 ℃進(jìn)行200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜2 h。經(jīng)1 h 室溫封閉后，與EGFR3 一抗（1∶1 500）4 ℃孵育過夜，并以β-actin 作為內(nèi)參照（1∶2 000）。次日二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h 后將PVDF 膜經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑處理，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光并采集圖像，各條帶的平均A 值由Image J 圖像分析軟件測定。EGFR3以相對(duì)表達(dá)量表示。

1.5 斑馬魚淋巴管生成情況觀察 將所收集的斑馬魚卵置于培養(yǎng)皿的Egg water 中，在普通體視顯微鏡下觀察斑馬魚的生長情況。斑馬魚以自然成對(duì)交配的方式進(jìn)行繁殖，受精后24 h后更換Egg water，并將魚卵放置于12 孔板中，每孔18～20 枚。受精后2、3、4 d 時(shí)更換培養(yǎng)液，受精后4 d 將斑馬魚卵隨機(jī)分成2 組（每組20 尾），觀察2 組加入20 mmol/L 的MAP2K6-FP，對(duì)照2 組加入等量生理鹽水，后置于28.5 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。把斑馬魚置入冰水中麻醉，將麻醉的斑馬魚胚胎置于滴加了3%的甲基纖維素的透明載玻片上，觀察兩組斑馬魚淋巴管生成情況，并照相。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較 裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較見表1。

表1 兩組裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較（±s）

表1 兩組裸鼠腹圍、腹水量、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)數(shù)、瘤體重量比較（±s）

注：與對(duì)照1組比較，*P＜0.05。

組別觀察1組對(duì)照1組腹圍（mm）73.00±1.23*84.00±3.60腹水量（mL）0.29±0.03*1.16±0.15轉(zhuǎn)移器官數(shù)（個(gè)）2.80±0.44*7.20±0.44瘤結(jié)節(jié)數(shù)（個(gè)）44.60±3.51*115.00±4.85瘤體重量（g）0.30±0.03*1.28±0.33

2.2 兩組裸鼠移植瘤中VEGFR-3、LYVE-1、D2-40、EGFR3 表達(dá)比較 觀察1 組VEGFR-3 陽性率27.1%、LYVE-1 陽性率32.3%、D2-40（3.10±0.72）個(gè)/視 野、EGFR3 0.22 ± 0.01，對(duì) 照1 組 分 別 為73.8%、80.3%、（9.31 ± 1.68）個(gè)/視 野、0.34 ±0.02，兩組比較，P均＜0.05。

2.3 兩組斑馬魚淋巴管生成情況比較 觀察2 組魚腹部不能形成連續(xù)的管腔，對(duì)照2 組魚腹部可見三條管腔伴行。

圖1 斑馬魚外形和熒光鏡下斑馬魚淋巴管情況

3 討論

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的失活以及異常細(xì)胞信號(hào)通路的激活有關(guān)［6］。大多數(shù)卵巢癌患者易復(fù)發(fā)，對(duì)化療有耐藥性，鉑類耐藥患者預(yù)后差，對(duì)進(jìn)一步化療的反應(yīng)率低，且中位生存期低于12 個(gè)月［7］。獲得性耐藥已成為卵巢癌治療中的一個(gè)重要問題，普遍存在化療耐藥（順鉑、紫杉醇等），部分原因是卵巢癌細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧生成減少［10］。有研究［11］表明，卵巢癌化療耐藥性的原因可能是參與對(duì)化療引起的DNA 損傷反應(yīng)的修復(fù)通路的冗余，這些通路可能是并行作用的，如果負(fù)責(zé)觸發(fā)鉑化療后細(xì)胞死亡的修復(fù)通路缺乏，另一種替代修復(fù)通路會(huì)補(bǔ)償并驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞修復(fù)損傷，導(dǎo)致化療耐藥性，因此推動(dòng)DNA 修復(fù)通路對(duì)鉑化療或靶向治療的敏感性，從而可以克服卵巢癌化療耐藥。卵巢癌患者對(duì)鉑類化療藥產(chǎn)生耐藥性具有復(fù)雜性，包括不同種類的疾病，目前遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有被完全理解。因此，我們迫切需要研究卵巢癌的化療耐藥機(jī)制，以克服卵巢癌治療效果差和患者預(yù)后不良的問題。

本課題組前期通過原核表達(dá)的方法成功構(gòu)建MAP2K6-FP，其是一種特異性靶向卵巢癌的具有細(xì)胞殺傷力的融合肽，在體外水平能通過誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的自噬性死亡而增加其對(duì)DDP 的敏感性。本實(shí)驗(yàn)我們一方面構(gòu)建順鉑耐藥卵巢癌移植瘤模型，以便更清楚地觀察MAP2K6-FP 對(duì)順鉑耐藥卵巢癌在體內(nèi)的作用，另一方面應(yīng)用斑馬魚模式生物模型進(jìn)一步驗(yàn)證MAP2K6-FP 在淋巴管發(fā)生過程所起的作用［12-13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MAP2K6-FP 作用于順鉑耐藥卵巢癌移植瘤后，觀察1 組細(xì)胞的生長速度明顯慢于對(duì)照1 組，腹圍增長緩慢。至治療結(jié)束后剖腹觀察觀察1組裸鼠腹水量明顯小于對(duì)照1組，腫瘤播散器官數(shù)、瘤結(jié)節(jié)總數(shù)及瘤體總重量均明顯低于對(duì)照1 組。這些大體觀察結(jié)果均表明，MAP2K6-FP 能夠抑制順鉑耐藥卵巢癌移植瘤的生長。分析其機(jī)制，可能與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。

研究［14-17］顯示，LYVE-1 和D2-40 是近些年來發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)重要的淋巴管標(biāo)志物。相對(duì)腫瘤新生血管研究而言，卵巢癌的淋巴管轉(zhuǎn)移方面的研究卻甚少，長期以來對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移規(guī)律及處理重視不夠，認(rèn)識(shí)不深。在轉(zhuǎn)基因鼠和其他體外模型中的研究已證實(shí)腫瘤主要通過表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-3信號(hào)途徑誘導(dǎo)淋巴管生成。而利用VEGF受體抑制劑來抑制腫瘤組織和淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴管新生能有效抑制早期腫瘤的轉(zhuǎn)移［18-20］。本文結(jié)果顯示，VEGFR-3、LYVE-1和D2-40 在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞膜和胞質(zhì)呈棕黃色，觀察1組的陽性率均低于對(duì)照1組。觀察1組D2-40為（3.10±0.72）個(gè)/視野，對(duì)照1組中為（9.31±1.68）個(gè)/視野，且管腔內(nèi)未見紅細(xì)胞填充。MAP2K6-FP作用于順鉑耐藥移植瘤后，VEGFR-3、LYVE-1 和D2-40 表達(dá)均下降，提示MAP2K6-FP 能夠一定程度抑制淋巴管生成。臨床上卵巢癌的轉(zhuǎn)移性極高并常見轉(zhuǎn)移至腹部大網(wǎng)膜。這種遷移機(jī)制依賴于轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞對(duì)表皮生長因子受體家族相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)作用，尤其是增加EGFR3 的表達(dá)［17］。本研究中MAP2K6-FP 作用于順鉑耐藥移植瘤，移植瘤組織中EGFR3 的表達(dá)較對(duì)照1 組低，提示MAP2K6-FP 能夠抑制EGFR3的表達(dá)，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，觀察2 組20 mmol/L 的MAP2K6-FP 作用于斑馬魚后，可見明顯的斑馬魚形態(tài)的變化，出現(xiàn)心包積液及胸導(dǎo)管分離的情況，在熒光體式顯微鏡下進(jìn)行淋巴管的觀察，可以觀察到淋巴管的生成受到抑制，沒有形成連續(xù)的管腔；而對(duì)照2 組的斑馬魚發(fā)育過程沒有很大的影響，魚腹部可見三條管腔伴行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MAP2K6-FP 能夠抑制斑馬魚淋巴管的生成，進(jìn)一步印證上述機(jī)制。

總之，MAP2K6-FP 可以抑制裸鼠順鉑耐藥卵巢癌移植瘤生長，機(jī)制可能是通過抑制淋巴管生成而實(shí)現(xiàn)；斑馬魚淋巴管生成受MAP2K6-FP抑制可進(jìn)一步印證上述機(jī)制。