■高 陽 張國慧 郭曉淼 紀志誠 譚曉彤 杜 鑫 周業(yè)勛 張丹丹*

（1.白城師范學院生命科學學院，吉林白城 137000；2.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193）

現今，在集約化、規(guī)模化的養(yǎng)豬模式中，仔豬斷奶日齡逐漸提前，這既能加快豬場的周轉率，還能提高母豬的利用率[1]。然而，斷奶日齡的提前會給仔豬帶來嚴重的應激反應。斷奶后環(huán)境變化與腸道生理負擔嚴重影響了仔豬的生長性能，繼而影響豬場經濟效益[2]。眾所周知，腸道在仔豬的消化系統(tǒng)中扮演重要角色，發(fā)育健全的腸道功能不僅為消化酶提供適宜的催化場所，還為腸道菌群提供良好的定植環(huán)境[3]。因此，在“全面禁抗”的大環(huán)境下，尋求新型、高效的飼料添加劑，改善斷奶仔豬腸道發(fā)育對養(yǎng)豬產業(yè)具有十分重要的現實意義。

角鯊烯是一種天然不飽和三萜，廣泛存在于動物肝臟和皮膚中。1916年，日本學者在鯊魚肝臟中提取出角鯊烯。最初，角鯊烯多用于皮膚表面單態(tài)氧的清除和改善心臟的缺氧耐受力。隨后，體內試驗進一步證明角鯊烯的佐劑安全性和飼用可行性。研究表明，角鯊烯對種公豬精液品質具有較好的改善作用[4]。Gabás-rivera等[5]研究表明，補飼角鯊烯可增加小鼠血清中高密度脂蛋白和對氧磷酶-1的水平，并緩解小鼠的氧化應激損傷。也有研究指出角鯊烯能改善羅斯雞胸肌肉品質[6]。然而，角鯊烯作為畜禽飼料添加對斷奶仔豬的效果很少有報道。眾所周知，腸道健康關系著動物的生長性能和經濟效益，健全的腸道屏障和腸道機能有利于維持腸道穩(wěn)態(tài)和菌群定植。因此，本試驗利用角鯊烯作為飼料添加劑，探究其對斷奶仔豬腸道發(fā)育、腸道菌群及消化機能的影響，為角鯊烯在斷奶仔豬生產中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

純度約為92%的角鯊烯，宜春大海龜生命科學有限公司；抗氧化指標試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；核酸提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光染料，天根生化科技有限公司；試驗所需抗體，Abcam（上海）貿易有限公司。

1.2 試驗動物分組與設計

試驗選擇24 頭25 日齡的斷奶三元雜交豬（杜×長×大），體重相近且均為去勢雄性。試驗采用單因子隨機區(qū)組設計，將動物隨機分為兩個處理，每個處理6 個重復，每個重復2 頭仔豬。A 組和B 組仔豬飼糧中角鯊烯添加水平分別為0 和250 mg/kg。預試期3 d，正試期25 d，所有仔豬自由飲水和采食，每日記錄采食量和剩料量。飼養(yǎng)試驗于2021 年7 月在吉林省四平市梨樹市四棵樹鄉(xiāng)養(yǎng)殖合作社進行。

1.3 試驗飼糧

基礎日糧營養(yǎng)水平參考NRC（2012）和《動物營養(yǎng)參數及飼養(yǎng)標準》（2010版）[7-8]，基礎日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

1.4 測定指標及方法

試驗結束時，屠宰仔豬，打開仔豬腹腔收集空腸和回腸樣本，每個腸段收集4份，1份置于4%多聚甲醛溶液中，其余3份液氮預冷，轉置-80 ℃冰箱中。盲腸內容物收集在2 mL凍存管中，液氮預冷，轉置-80 ℃冰箱中。

H.E.染色切片處理與分析參照沈夢城[9]的方法。將收集到的仔豬空腸和回腸樣本置于4%多聚甲醛中固定48 h，設置Thermo Fisher Scientific 1000D型全自動脫水機Daytime Rapidly 程序，依次浸入60%、70%、75%、80%、95%和100%。置于二甲苯中透明后，浸泡于脫水系統(tǒng)的蠟液中，包埋。設置切片機參數，空腸厚度5.5 μm，回腸5 μm。經攤片烘干后，置于Thermo Fisher Scientific 24-4 型全自動切片染色機，按內置程序染色，中性樹膠封片。使用Toupview（X86）軟件對空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度測量，并計算絨毛高度/隱窩深度值。

RT-PCR 中mRNA 提取、反轉及IGF-1和GLP基因mRNA 相對表達量及IGF-1 和GLP 蛋白相對表達量的測定均參照Zhao 等[10]的方法。采用Primer Premier 6.0 軟件進行PCR 引物設計，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列

腸道胰蛋白酶（A080-2）、淀粉酶（C016-2）和脂肪酶（A054-1）的活性使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒檢測，按說明書步驟操作。

盲腸內容物微生物組成檢測采用RT-PCR，具體方法參照溫曉鹿等[11]的方法。采用（Tiangen公司）試劑盒提取盲腸內容物總細菌DNA，應用ND-1000型核酸分析儀檢測DNA濃度，然后使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。將總細菌DNA分別與不同濃度的總細菌、大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的標準指令進行qPCR 檢測，再通過標準質粒濃度與Ct值做回歸分析，獲得回歸曲線，將樣品Ct值代入回歸方程計算得到目標菌屬的DNA拷貝數，結果以每克盲腸內容物中細菌拷貝數的常用對數表示（單位：lg 拷貝數/g）。

1.5 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0 軟件中的one-way ANOVA 進行數據分析，采用LSD模塊進行差異顯著性檢驗，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準，試驗數據均以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示。采用Origin pro 9.1 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道發(fā)育的影響（見表3、表4、圖1、圖2）

表3 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道發(fā)育的影響

表4 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道IGF-1和GLP蛋白相對表達量的影響

由表3 可知，飼糧添加250 mg/kg 角鯊烯可顯著提高斷奶仔豬空腸和回腸絨毛高度（P＜0.05），并降低隱窩深度，但差異不顯著（P＞0.05）。此外，飼糧添加250 mg/kg角鯊烯，仔豬空腸、回腸絨毛高度/隱窩深度值顯著升高（P＜0.05）。由圖1 可知，飼糧添加角鯊烯可顯著提高斷奶仔豬空腸和回腸組織中IGF-1和GLP基因mRNA 相對表達量（P＜0.05）。由表4 和圖2可知，角鯊烯可顯著提高斷奶仔豬空腸及回腸組織中IGF-1蛋白和GLP蛋白相對表達量（P＜0.05）。

圖1 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道IGF-1和GLP基因mRNA相對表達量的影響

圖2 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道IGF-1和GLP蛋白相對表達量的影響

2.2 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道消化酶活性的影響（見表5）

由表5可知，飼糧添加角鯊烯可顯著提高空腸食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性（P＜0.05）。飼糧添加角鯊烯能顯著提高斷奶仔豬回腸食糜中淀粉酶活性（P＜0.05），但是，飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬回腸食糜中胰蛋白酶和脂肪酶活性無顯著影響（P＞0.05）。

表5 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道消化酶活性的影響（IU/mg）

2.3 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道抗氧化性能的影響（見表6）

由表6可知，飼糧添加角鯊烯可顯著降低斷奶仔豬空腸和回腸組織中MDA 含量（P＜0.05），同時顯著提高仔豬空腸和回腸組織中SOD 與GSH-Px 的活性（P＜0.05）。

表6 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬腸道抗氧化性能的影響

2.4 飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬盲腸微生物組成的影響（見圖3）

由圖3可知，飼糧添加角鯊烯對斷奶仔豬盲腸內容物總細菌數量無顯著影響（P＞0.05）。飼糧添加角鯊烯能顯著降低斷奶仔豬盲腸內容物中大腸桿菌的數量（P＜0.05），同時顯著提高乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量（P＜0.05）。

圖3 角鯊烯對斷奶仔豬盲腸微生物組成的影響

3 討論

近年來，斷奶仔豬的腸道發(fā)育狀態(tài)得到了廣泛關注與研究。一般認為，仔豬的腸道在42～45 d 發(fā)育健全，而仔豬的斷奶多為21～35 d[12-13]。研究表明，斷奶后，仔豬腸道的應激損傷會加速腸上皮細胞凋亡，阻礙腸道發(fā)育，對仔豬的免疫和消化功能也產生嚴重影響[14-15]。因此，仔豬快速度過斷奶應激并完成腸道發(fā)育，對其健康生長具有重要的意義。角鯊烯具有機體抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)和心血管保護等功能[16]。研究表明，飼糧添加125～250 mg/kg 角鯊烯能夠改善早期斷奶仔豬生長性能和抗氧化性能，促進空腸絨毛生長[17]。該試驗結果表明，飼糧添加角鯊烯能顯著提高斷奶仔豬空腸和回腸VH 和VCR，同時顯著提高空腸組織中IGF-1和GLP基因相對表達量及IGF-1和GLP蛋白的相對表達量。GLP-2 蛋白通過調控蛋白質合成速率，促進腸道細胞增殖并抑制細胞凋亡，防止腸黏膜萎縮[18]。此外，GLP 蛋白可以刺激腸道上皮成纖維細胞產生IGF-1，IGF-1可以誘導隱窩的增殖、絨毛的伸長和腸道屏障功能的完整性[19]。在上述過程中，得益于角鯊烯良好的流動性，使其可以在腸道上皮均勻分布，發(fā)揮抗炎及抑菌作用，為空腸和回腸絨毛的發(fā)育提供有利條件。

眾所周知，腸道消化酶的活性受多種因素制約（如動物年齡、腸道穩(wěn)態(tài)、生理階段和健康狀況等）。一般認為，發(fā)育良好的腸道結構有利于發(fā)揮消化酶的高效性。一方面，良好腸道屏障和腸道穩(wěn)態(tài)能為消化酶提供反應場所；另一方面，健康的腸道環(huán)境有利營養(yǎng)物質進入循環(huán)系統(tǒng)。該研究中，飼糧添加角鯊烯顯著提高斷奶仔豬空腸食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，并有效改善空腸中上述消化酶活性。已有研究表明，早期斷奶仔豬飼糧中添加角鯊烯能促進空腸絨毛生長，降低空腸隱窩深度并改善空腸黏膜層通透性[17]。此外，角鯊烯在改善腸道緊密連接蛋白表達量方面也發(fā)揮重要作用。因此，可初步認為角鯊烯可能在維持腸道結構與功能穩(wěn)定性中扮演重要角色，繼而改善空腸與回腸中消化酶的活性。

飼糧的改變是導致斷奶仔豬腸道應激的重要因素之一，仔豬的營養(yǎng)源從母乳變?yōu)橹参镄燥暳希暭Z中的纖維雖能促進腸道的發(fā)育，但更容易造成絨毛受損，導致腸細胞抗氧化性能降低和腸屏障通透性增大，進而影響腸道的發(fā)育及功能[20]。研究表明，肉雞和大鼠補飼角鯊烯能顯著降低血清、肝臟和肌肉組織中的MDA 水平，并提高SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活性[6,21-22]。該研究表明，飼糧添加250 mg/kg 角鯊烯能顯著提高斷奶仔豬空腸、回腸組織中SOD 和GSH-Px活性，并降低MDA含量。其原因可能有兩方面；一方面角鯊烯自身具備良好的單態(tài)氧清除能力，在清除自由基和超氧陰離子的同時，調控機體多種抗氧化酶的活性，二者協(xié)同作用改善仔豬腸道抗氧化機能；另一方面，角鯊烯通過維持三羧酸循環(huán)酶和呼吸標記酶活性，改善能量狀態(tài)并增強線粒體的抗氧化能力。

正常情況下，仔豬的腸道菌群結構處于動態(tài)平衡，有益菌群和有害菌群相互博弈，共同影響宿主的健康狀態(tài)[11]。然而，斷奶應激會打破仔豬腸道中原有的微生物穩(wěn)態(tài)，進而導致腹瀉、消化酶活性降低和采食量降低等問題[23]。該研究中，飼糧添加角鯊烯可顯著降低仔豬盲腸內容物中大腸桿菌數量，并提高乳酸桿菌和雙歧桿菌數量。其原因可能是角鯊烯在維持腸道結構中發(fā)揮重要作用。良好的腸道結構為益生菌的定植提供條件，進而競爭性抑制有害菌的增殖，維持動物腸道菌群結構穩(wěn)態(tài)，有利于腸道發(fā)育和動物生長。

4 結論

角鯊烯可提高斷奶仔豬空腸和回腸的VH 和VCR，提高空腸和回腸內容物中消化酶活性，增強腸道的抗氧化機能并改善盲腸內容物的微生物組成。