齊 奇，李艷霞，楊 凱，趙玉紅,3,*

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省林業(yè)科學研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；3.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅松（Sieb. et Zucc）是松科松屬植物，主要分布在我國東北地區(qū)。紅松仁是成熟的紅松種子去殼皮后得到的種仁，蛋白質(zhì)量分數(shù)在13%～20%之間，構成松仁蛋白的氨基酸種類齊全，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)來源。關于松仁蛋白研究主要集中在性質(zhì)、抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血壓以及松仁乳的制備等方面。

松仁粕（pine kernel meal，PKM）是由紅松仁脫脂后得到的，含有大量蛋白質(zhì)，通過堿溶酸沉法可以提取分離蛋白（protein isolates，PI），松仁PI中含有球蛋白（globulin，Glo）、清蛋白（albumin，Alb）和谷蛋白（gluten，Glu），這幾種蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)和功能特性上存在差異，在不同的pH值和溫度下松仁蛋白的溶解性和乳化性變化趨勢不同。偃松松仁蛋白具有較高的溶解性、乳化性、起泡性，不同的提取方法影響松仁蛋白功能特性。

多酚化合物對人體健康有促進作用，功能作用的表現(xiàn)與多酚-蛋白質(zhì)之間的相互作用密切相關。在蛋白質(zhì)的提取過程中，高活性的酚類物質(zhì)在堿性條件下與蛋白質(zhì)的巰基（—SH）和氨基（—NH）共價結(jié)合，或在低pH值條件下通過氫鍵非共價結(jié)合，使提取的蛋白產(chǎn)生較深的顏色和苦味。酚類物質(zhì)可以通過誘導蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)，改變蛋白質(zhì)表面凈電荷。這種相互作用也會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構，影響蛋白質(zhì)表面性質(zhì)，使其在本質(zhì)上具有親水性，進而影響乳化、起泡等功能特性。Jiang Jiang等發(fā)現(xiàn)綠原酸通過非共價鍵與乳清蛋白和酪蛋白相互作用，蛋白質(zhì)結(jié)構發(fā)生改變，總巰基和表面疏水性降低，但溶解性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著提高。Yan Shizhang等通過研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigall ocatechin gallate，EGCG）與大豆分離蛋白的相互作用，表明EGCG改變了蛋白質(zhì)的三級構象和二級結(jié)構，使大豆蛋白表現(xiàn)出更佳的溶解性和乳化性。Li Changhong等向乳鐵蛋白中加入原花青素，乳鐵蛋白的表面疏水性降低，起泡性和起泡穩(wěn)定性增加。加入外源酚類化合物對蛋白質(zhì)結(jié)構和性質(zhì)有影響，但關于植物中內(nèi)源多酚對蛋白質(zhì)影響的研究卻比較有限。松仁中含有5%左右的多酚，是松仁中的主要生物活性成分，而內(nèi)源多酚對松仁蛋白各組分的性質(zhì)和結(jié)構的影響鮮見報道。

本研究通過對PKM和脫酚松仁粕（dephenolized pine kernel meal，DPKM）中PI、Glo、Alb和Glu的理化性質(zhì)、功能特性以及結(jié)構進行研究，探討內(nèi)源多酚對松仁各組分蛋白性質(zhì)影響的結(jié)構因素，旨在為紅松PKM的綜合利用以及相關產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松松籽由黑龍江省林科院提供。

三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、-巰基乙醇、考馬斯亮藍G-250、5,5-二巰基-2,2-二硝基苯甲酸（5,5-dimercapto-2,2-dinitrobenzoic acid，DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

TDL-40B-W型高速離心機 上海恒勤儀器設備有限公司；722型可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司；FD5-2.5E型冷凍干燥機 北京金西盟儀器有限公司；CM-5型色差儀 日本Konica Minolta公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；LS55熒光分光光度計 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

PKM制備：將紅松松籽手工去殼皮后粉碎機粉碎，索氏抽提法將PKM脫脂，放置在通風廚中室溫風干，將干燥的PKM在粉碎機中粉碎，過60 目篩，4 ℃貯藏，備用。

DPKM制備：參考Yan Xianghui等的方法并略作改動。按照料液比1∶20（g/mL）將PKM與80%乙醇溶液溶解，室溫下磁力攪拌2 h，4 000 r/min離心15 min，重復上述步驟3 次，收集沉淀并置于通風櫥內(nèi)24 h，待有機溶劑充分揮發(fā)后即得DPKM。

1.3.2 PKM和DPKM中成分測定

蛋白質(zhì)含量測定：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；水分含量測定：采用GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；灰分含量測定：采用GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》；粗脂肪含量測定：采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》。用100%減去粗蛋白質(zhì)、水分、灰分和粗脂肪的總和估算碳水化合物含量。總酚含量采用福林-酚比色法，以沒食子酸為標準，通過紫外分光光度法在765 nm波長處測量，結(jié)果以g/100 g（干質(zhì)量）的沒食子酸當量表示。

1.3.3 PKM和DPKM顏色測定

利用色差儀對PKM和DPKM進行顏色測定，并記錄*、*和*值。

1.3.4 松仁各組分蛋白質(zhì)的制備

松仁PI制備參考Tang Chuanhe等的方法并略作改動。PKM與蒸餾水按照1∶10（g/mL）的料液比溶解，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH 9.0，磁力攪拌1 h，4 000 r/min離心20 min，取上清液，在用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH 4.5，磁力攪拌1 h，4 000 r/min離心20 min，沉淀即為松仁PI，將沉淀調(diào)制中性，將蛋白樣品冷凍干燥并在－20 ℃保存，備用。

Alb制備參考Gammoh等的方法并略作改動。PKM與蒸餾水以1∶10（g/mL）的比例用磁力攪拌器攪拌1 h，4 000 r/min離心20 min，分離上清液和殘留物，上清液在－18 ℃冷凍，隨后使用冷凍干燥機進行凍干。

Glo制備參考Gammoh等的方法并略作改動。將提取Alb后的殘留物加入100 mL 10% NaCl溶液溶解，然后攪拌1 h，4 000 r/min離心20 min，將上清液冷凍干燥，凍干后在－18 ℃保存。

Glu制備參考Gammoh等的方法并略作改動。使用pH計將提取的Glo殘留物溶解在100 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，調(diào)至pH 10.0，攪拌1 h，4 000 r/min離心20 min。所得上清液在－18 ℃冷凍后在冷凍干燥機中凍干。

同樣的方法提取DPKM中各組分蛋白質(zhì)。

1.3.5 松仁各組分蛋白性質(zhì)測定

1.3.5.1 松仁各組分蛋白質(zhì)含量和純度的測定

采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，按式（1）計算蛋白質(zhì)純度：

式中：為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為待測樣品溶液的體積/mL；為稀釋倍數(shù)；為蛋白質(zhì)凍干粉的質(zhì)量/mg。

1.3.5.2 巰基、二硫鍵含量測定

參考Beveridge等的方法。每個蛋白樣品取75 mg充分溶解于10 mL 8 mol/L尿素-Tris-Gly緩沖液中。測定游離巰基的方法：1 mL上述蛋白溶液中加入4 mL Tris-Gly緩沖液、0.05 mL Ellman試劑（DTNB），反應5 min后于412 nm波長處測定吸光度?？値€基測定：1 mL蛋白溶液中加入0.05 mL-巰基乙醇、4 mL Tris-Gly緩沖液，室溫反應1 h，加入10 mL 12%三氯乙酸溶液，繼續(xù)反應1 h，4 000 r/min離心10 min，沉淀中加入5 mL 12%三氯乙酸溶液并再次以相同條件離心。收集沉淀，將其溶于10 mL Tris-Gly緩沖液，移取4 mL，加入0.04 mL Ellman試劑，反應5 min后于412 nm波長下測定吸光度。按式（2）、（3）計算游離巰基含量和二硫鍵含量：

式中：為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為稀釋常數(shù)；73.53為摩爾吸光系數(shù)，由10/（1.36×10）計算得到。

1.3.5.3 表面疏水性含量測定

參考Malik等的方法并略作改動。利用0.01 mol/L的PBS（pH 7.0）配制0～2 mg/mL的樣品溶液，將4 mL的樣品溶液與20 μL 8 mmol/L ANS溶液混合。激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，記錄熒光強度。

1.3.5.4 溶解性測定

配制各樣品蛋白質(zhì)量濃度1 mg/mL，溶解液為pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液。用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH溶液將pH值分別調(diào)至3.0～11.0，室溫磁力攪拌30 min，然后在4 000 r/min離心10 min，上清液采用Bradford法測定蛋白含量，用牛血清白蛋白作標準曲線，按照式（4）計算蛋白溶解性：

1.3.5.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

參考劉昱迪等的方法并略作改動。配制1 g/100 mL蛋白溶液，加入5 mL大豆油，將溶液pH值調(diào)至9.0。以13 600 r/min的速率均質(zhì)2 min。分別從每個容器底部取50 μL的乳劑，在第0和30分鐘時分散于5 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的SDS溶液中，在500 nm波長處測定吸光度。記錄立即測得的吸光度（）和30 min后測得的吸光度（）。利用式（5）、（6）計算乳化性和乳化穩(wěn)定性：

式中：DF為稀釋倍數(shù)；為乳化液的油體積分數(shù)/%；為乳化前的蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；為光程（1 cm）；Δ為30 min。

1.3.5.6 起泡性及起泡穩(wěn)定性測定

配制10 mg/mL的樣品溶液30 mL，將溶液pH值調(diào)至9.0。以20 000 r/min的速率均質(zhì)2 min，迅速倒入50 mL的量筒里，分別在第0（）和30分鐘（）記錄泡沫體積。利用式（7）、（8）計算起泡性和起泡穩(wěn)定性：

1.3.6 松仁各組分蛋白結(jié)構測定

參考Yan Cuijun等的方法并略作改動。將干燥的樣品按1∶100的比例與KBr混合后研磨成粉末，壓成薄片，使用FTIR儀進行掃描。掃描范圍為400～4 000 cm，以4 cm的分辨率共掃描16 次。

1.3.6.2 內(nèi)源熒光光譜分析

參考王晨等的方法并略作改動。將各組分蛋白樣品用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋到2 mg/mL進行測定，設定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長范圍為300～450 nm，狹縫寬度均為10 nm，進行熒光光譜掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 PKM和DPKM中主要成分和顏色分析

表1 PKM和DPKM主要成分和顏色Table 1 Major components and color parameters of PKM and DPKM

由表1可知，PKM和DPKM的蛋白質(zhì)量分數(shù)分別為66.84%、73.29%，DPKM的粗蛋白含量顯著增加（＜0.05），這可能是因為多酚脫除后導致多酚與蛋白質(zhì)相互作用減弱，使得更多的蛋白質(zhì)暴露出來。與PKM相比，DPKM的灰分、碳水化合物以及總酚含量顯著降低，該結(jié)果與Malik等研究的酚類物質(zhì)對葵花籽蛋白基礎成分影響的趨勢相同。而PKM和DPKM的水分和脂肪含量并沒有顯著差異，兩種樣品的脂肪質(zhì)量分數(shù)都在1.9%左右。

PKM和DPKM的*、*和*值如表1所示。相比于PKM，DPKM的*值降低，*和*值升高，因此經(jīng)乙醇脫多酚后會導致DPKM亮度降低并偏向褐色。

2.2 各組分蛋白質(zhì)量分數(shù)以及多酚含量分析

表2 PKM和DPKM各組分蛋白和多酚含量測定Table 2 Protein and polyphenol contents in protein fractions from PKM and DPKM

由表2可知，與PKM相比，DPKM的蛋白質(zhì)含量顯著增高，其中PI和Glu的含量相對較高。這可能是由于在堿性條件下，多酚與蛋白質(zhì)相互作用導致蛋白質(zhì)含量降低。通過80%乙醇溶液進行脫酚處理，使松仁各組分蛋白的多酚含量分別降低了89.34%、83.98%、86.71%、91.49%，說明脫酚效果顯著。

首先，能推進財務人員加強崗位工作再認識，做到依法理財；可以促進財務人員深入思考本職崗位工作職責，自覺提高依法理財意識；促進財務人員自覺地調(diào)節(jié)自己的行為，形成正確的財務道德觀，確保國有資產(chǎn)安全，防范經(jīng)營風險。

2.3 表面疏水性以及巰基、二硫鍵含量分析

表面疏水性決定了蛋白質(zhì)的乳化、發(fā)泡等功能特性。如表3所示，與DPKM相比，PKM的各組分蛋白的表面疏水性顯著增加。原因可能是松仁蛋白與內(nèi)源多酚的相互作用，引起蛋白質(zhì)的構象變化，使得蛋白結(jié)構展開，疏水性基團增加。也可能與溶解性相關，溶解性越低，蛋白表面疏水性基團越多，表面疏水性值越大。PKM的溶解性顯著低于DPKM，所以PKM的表面疏水性較大。因此，可以推斷脫酚處理抑制了多酚-蛋白相互作用，使蛋白質(zhì)的結(jié)構發(fā)生改變。其中PKM和DPKM疏水性最大的蛋白質(zhì)都為Alb，分別是970.20、655.40，疏水性最弱的都為Glo，分別是295.03、147.60，可以認為PKM的表面疏水性主要是由于Alb表面疏水性基團的作用所致。

測定游離巰基和二硫鍵的含量，可以評價蛋白質(zhì)的三級結(jié)構。蛋白質(zhì)的巰基，尤其是半胱氨酸的游離巰基，具有較高的化學活性，易受多酚的作用，從而影響蛋白質(zhì)的功能特性。如表3所示，相對于DPKM，PKM各組分蛋白的總巰基及游離巰基明顯降低，二硫鍵含量增加。這些結(jié)果表明，在氧和堿性條件下，蛋白質(zhì)溶液中酚類化合物與半胱氨酸殘基具有較強的反應活性，誘導蛋白質(zhì)結(jié)構部分展開，有助于巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵。酚類化合物也可以被氧化成醌，從而催化巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)化，導致巰基的進一步丟失。PKM各組分蛋白的二硫鍵含量顯著高于DPKM。二硫鍵是天然存在于蛋白質(zhì)中唯一的共價側(cè)鏈交聯(lián)，有利于蛋白質(zhì)空間結(jié)構的穩(wěn)定，因此推斷PKM的結(jié)構更穩(wěn)定，熱穩(wěn)定也更好。

表3 PKM和DPKM各組分蛋白的表面疏水性、巰基及二硫鍵含量Table 3 Surface hydrophobicity and sulfydryl and disulfide bond contents in protein fractions from PKM and DPKM

2.4 溶解性分析

圖1 PKM和DPKM各組分蛋白的溶解性Fig. 1 Solubility of protein fractions from PKM and DPKM

如圖1所示，PKM和DPKM各組分蛋白的溶解性都呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。可以推斷酚類化合物在堿性條件下易被氧化形成共價鍵和氫鍵。其中在pH 5.0時溶解性最小，pH 11.0時溶解性最大，這與之前報道過香樟籽PI溶解性的趨勢相同。這是因為蛋白質(zhì)在等電點處不帶凈電荷，使蛋白質(zhì)之間不存在排斥力，而這種相互作用不利于蛋白質(zhì)溶解性。但在堿性環(huán)境下可能會增強蛋白質(zhì)與水的相互作用，從而增加其溶解性。

在相同pH值下，相對于DPKM，PKM各組分蛋白質(zhì)的溶解性降低。Malik等在研究多酚對葵花籽粕溶解性的影響時也出現(xiàn)相似的結(jié)果。Rawel等也報道過類似結(jié)論，認為蛋白質(zhì)與酚類化合物反應伴隨著相應親水基團的封閉和芳香環(huán)結(jié)構的引入，有利于蛋白質(zhì)疏水性的提高，進而降低溶解性。

2.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析

圖2 PKM和DPKM各組分蛋白的乳化性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）Fig. 2 Emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of proteins from of PKM and DPKM

如圖2A所示，pH 9.0時PKM各組分蛋白的乳化性顯著高于DPKM的各組分蛋白。Yan Shizhang等研究EGCG與大豆分離蛋白相互作用也出現(xiàn)相似結(jié)果?？赡苁欠宇惢衔锱c蛋白質(zhì)的共價復合物提供了更多的羧基，使蛋白質(zhì)的乳化性得以改善。也可能是因為表面疏水性和溶解性可以相互或單獨影響乳化性能，表面疏水性越大越能增強蛋白質(zhì)在油水界面的吸附能力。PKM各組分蛋白的表面疏水性顯著高于DPKM，因此PKM各組分蛋白的乳化性更強。其中PKM和DPKM的乳化性能為Glu＞Alb＞PI＞Glo，Glu的乳化性最強，這可能與蛋白質(zhì)的提取方法和蛋白質(zhì)含量有關，堿性環(huán)境下提取的Glu可以有效地增大蛋白質(zhì)的溶解性，使得乳化性增大。

如圖2B所示，與PKM相比，DPKM的乳化穩(wěn)定性普遍增加，說明多酚的存在明顯使乳液穩(wěn)定性降低。Malik等對葵花籽粕和脫酚后葵花籽粕乳化穩(wěn)定性測定也出現(xiàn)相似結(jié)果。可以推斷脫除酚類物質(zhì)后更能增強蛋白質(zhì)在油-水界面的表面張力，使其形成的乳液粒徑更小，從而有效地穩(wěn)定水/油界面。其中Glu和PI乳化穩(wěn)定性普遍高于Glo和Alb，而Glu的乳化穩(wěn)定性依舊最強。

2.6 起泡性和起泡穩(wěn)定性分析

圖3 PKM和DPKM各組分蛋白的起泡性（A）和起泡穩(wěn)定性（B）Fig. 3 Foaming capacity (A) and foam stability (B) of protein components from PKM and DPKM

蛋白質(zhì)的起泡性是決定其在食品系統(tǒng)中應用的功能特性，在食品加工過程中具有重要作用，而起泡性的存在受到酚類化合物的影響較大。如圖3所示，pH 9.0時，DPKM各組分蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性都比PKM高，該結(jié)果與Suba?l等研究葵花籽蛋白質(zhì)以及去除酚類物質(zhì)后蛋白質(zhì)的起泡性以及起泡穩(wěn)定性趨勢相同。這可能與蛋白質(zhì)溶解性和疏水性的影響有關，由于酚類物質(zhì)的存在，使蛋白質(zhì)的溶解性下降，從而降低了起泡性和起泡穩(wěn)定性。

其中PKM和DPKM的起泡性均為Glu＞PI＞Alb＞Glo，PKM的起泡穩(wěn)定性Glu＞PI＞Glo＞Alb，DPKM的起泡穩(wěn)定性Glu＞PI＞Alb＞Glo。如圖3B所示，可以觀察到PKM-Alb的泡沫幾乎消失，說明極易展開。而Glu的起泡性和起泡穩(wěn)定性均最強，該結(jié)果與Liu Chengmei等研究的腰果蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性趨勢相似?？赡苁怯捎贕lu含有大量的疏水氨基酸，通過更強的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，容易在空氣-水界面之間形成更強的界面膜。因此，Glu是食品生產(chǎn)中重要的發(fā)泡成分，而DPKM更適用于不同食品的發(fā)泡劑。

2.7 FTIR分析

如圖4所示，得到了PKM和DPKM各組分蛋白在4 000～400 cm的光譜。觀察到酰胺I帶（1 600～1 700 cm，與C＝O鍵結(jié)合）、酰胺II帶（1 480～1 580 cm，對應N—H彎曲和C—N伸縮）和酰胺III帶（1 220～1 300 cm，對應C—O和C—O—C振動）。而與多酚的相互作用可以通過監(jiān)測酰胺I帶和酰胺II帶的光譜位移和強度變化，這與蛋白的二級結(jié)構有關。如圖4A～D所示，PKM與DPKM各組分蛋白的FTIR譜圖相似，表明沒有產(chǎn)生新的共價鍵，Jiang Jiang等在研究綠原酸對乳清蛋白和酪蛋白的作用時也報道了類似的結(jié)果。PKM和DPKM各組分蛋白在3 300 cm峰附近的變化主要是多酚與蛋白質(zhì)形成氫鍵。如圖4E～H所示，PKM和DPKM各組分蛋白在酰胺I帶和酰胺II帶的位置發(fā)生了偏移，可以推斷蛋白質(zhì)通過C=O、C—N和N—H與酚類化合物結(jié)合。從圖4可知，PKM與DPKM各組分蛋白均具有具有較強的酰胺I帶吸收峰，其中PKM的PI、Glo和Alb的波數(shù)較小，相比于PKM，DPKM的各組分蛋白分別發(fā)生2、4 cm和2 cm的紅移。而酰胺I的特征吸收峰與蛋白肽鏈骨架的有序程度密切相關，有序度越高，則酰胺I吸收峰波數(shù)越大，因此PKM的有序度較低。而酰胺帶的變化被認為是酚類化合物的廣泛影響，證明酚類化合物可以改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構。

圖4 PKM和DPKM各組分蛋白的FTIR光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of protein fractions from PKM and DPKM

PKM和DPKM各組分蛋白質(zhì)二級結(jié)構的定量分析結(jié)果見圖5。1 615～1 637 cm和1 682～1 700 cm分別為-折疊，1 637～1 648 cm為無規(guī)卷曲，1 648～1 664 cm為-螺旋，1 664～1 682 cm為-轉(zhuǎn)角。這些二級結(jié)構的形成與氫鍵相互作用密切相關。如圖5所示，PKM與DPKM各組分蛋白的二級結(jié)構相對含量略有變化，大約50%的二級結(jié)構被-折疊所占據(jù)，其次是-螺旋和-轉(zhuǎn)角結(jié)構。與DPKM相比，PKM的各組分蛋白的-螺旋、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量增加，-折疊相對含量降低，與Yan Cuijun等研究的核桃蛋白結(jié)構相似。據(jù)報道，二硫鍵可以促進蛋白質(zhì)結(jié)構的形成，而這些結(jié)構更容易形成-折疊，因此推斷酚類化合物可以促使二硫鍵的斷裂，引起-折疊相對含量的減少。這些構象變化可能直接改變蛋白質(zhì)的柔韌性，并可能對其功能特性產(chǎn)生特殊影響。

圖5 PKM和DPKM各組分蛋白的二級結(jié)構相對含量Fig. 5 Secondary structure contents of proteins from PKM and DPKM

2.8 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的固有熒光對極性微環(huán)境較為敏感，已被廣泛用于檢測蛋白質(zhì)三級結(jié)構的變化。芳香族氨基酸（色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），含有共軛雙鍵的苯環(huán)結(jié)構可以在特定激發(fā)波長下產(chǎn)生固有熒光。由于Tyr極易被猝滅，Phe量子產(chǎn)率過小，研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用常用Trp的熒光信息。

圖6 PKM和DPKM各組分蛋白的熒光光譜圖Fig. 6 Fluorescence spectra of proteins from PKM and DPKM

如圖6所示，是典型的Trp發(fā)射光譜，最大熒光吸收峰在348 nm附近，接近于Trp殘基（或其氨基化合物）在親水環(huán)境中的特征熒光峰。如圖6A、C和D所示，在發(fā)射光譜范圍為300～400 nm時，相對于DPKM，PKM的蛋白質(zhì)樣品的熒光強度降低?？赡苁嵌喾拥姆辑h(huán)與芳香族氨基酸（如Trp、Tyr）發(fā)生共價作用，誘導蛋白質(zhì)的三級結(jié)構展開，生色團暴露于親水環(huán)境中，導致在此光譜范圍內(nèi)熒光猝滅，進而熒光強度減弱。如圖6B所示，與DPKM相比，PKM的最大熒光發(fā)射光譜未發(fā)生明顯變化，表明Glo發(fā)色團微環(huán)境受酚類化合物的影響不大。PI的熒光強度更接近Alb，說明在松仁PI提取過程中，Alb的結(jié)構變化較大，而Alb本身松散的結(jié)構更易與多酚發(fā)生相互作用，因此，這可能是導致PI結(jié)構發(fā)生明顯變化的重要原因之一。鑒于PKM與DPKM各組分蛋白熒光強弱仍存在差異，可以推斷酚類化合物只是影響熒光強度變化的原因之一。

3 結(jié) 論

內(nèi)源多酚對松仁蛋白的結(jié)構和性質(zhì)具有顯著影響。脫酚處理有效降低了多酚含量（＜0.05）。脫酚后松仁各組分蛋白總巰基含量和游離巰基含量顯著升高，但二硫鍵含量和表面疏水性降低（＜0.05）。脫酚后蛋白質(zhì)的溶解性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性顯著提高（＜0.05），而乳化性降低。脫酚改變了松仁各組分蛋白的二級結(jié)構和三級結(jié)構。多酚脫除有利于將PKM中蛋白質(zhì)應用到不同領域。