李 碩，閆馨芝，李 響，俱 蓉，靳子明，王智勇，竇 霞△

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，甘肅 蘭州 730000；4.西北中藏藥協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000；5.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；6.甘肅省中藥現(xiàn)代制藥工程研究院有限公司，甘肅 蘭州 730000）

隨著生活節(jié)奏的加快，抑郁患者逐年增加，2015年抑郁障礙被估計(jì)為全世界第三大致殘?jiān)騕1]，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019年全球已有超過3.4億的抑郁癥患者，預(yù)計(jì)2020年中國(guó)的抑郁癥發(fā)病率將增至7.35%[2]。抑郁癥具有患病率高、治療率低及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，但目前對(duì)抑郁癥的生理、病理研究不完全明確，古代文獻(xiàn)有“郁”“癲證”“臟躁”“郁證”“不寐”“百合病”“奔豚”等記載[3]，認(rèn)為抑郁癥是腎陽不足、肝郁導(dǎo)致耗血使神失所養(yǎng)、肺氣失調(diào)引起[4-6]。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥應(yīng)定位于膽，可分為多型[7-8]，臨床醫(yī)學(xué)有去甲腎上腺素受體、5-HT受體、多巴胺受體、乙酰膽堿受體、小丘腦-垂體-腎上腺素軸等學(xué)說。目前臨床常用5-羥色胺再攝取制劑（SSRI）等，主要通過興奮神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮抗抑郁作用，但研究發(fā)現(xiàn)SSRI對(duì)患者的代謝功能、凝血功能等都有明顯的損害[9]，療效不佳、副作用大。近年來臨床試驗(yàn)表明，利用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療抑郁癥取得了明顯的效果，降低西藥的不良反應(yīng)，提高患者的治愈率和生活質(zhì)量[10]。治療抑郁癥常用的方劑有無憂湯緩解患者膽氣怯弱、夜不能寐的癥狀；逍遙散調(diào)和肝脾、疏肝解郁、養(yǎng)血健脾；當(dāng)歸芍藥散養(yǎng)血調(diào)肝、健脾利濕[11-13]。中醫(yī)藥副作用小、不易產(chǎn)生依賴性，在抑郁癥等精神疾病的干預(yù)治療方面具有較大的潛力。

當(dāng)歸作為十大隴藥之一，為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diel的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的功效[14]?，F(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸提取物具有舒張兔離體的十二指腸平滑肌、促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖分化、抑制前列腺增生、上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抑制鈣離子內(nèi)流、阻斷Cyt C釋放、抑制人肺腺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2。且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用明顯，目前集中于抗阿爾茲海默癥和腦中風(fēng)上的研究[15]，但對(duì)于抗抑郁癥的研究目前未得到重視。根據(jù)郭棟[16]的統(tǒng)計(jì)顯示，在治療抑郁癥方面當(dāng)歸的應(yīng)用僅次于茯苓、甘草，出現(xiàn)的頻率為35.91%。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明當(dāng)歸在治療抑郁癥時(shí)能促進(jìn)海馬組織再生、調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、清除氧自由基、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子含量、減輕細(xì)胞因子的炎癥癥狀[17]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不同于一般的藥理學(xué)研究，其研究不僅局限于單基因單靶點(diǎn)的研究，更側(cè)重于多基因多靶點(diǎn)的研究[18]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究符合中藥的整體觀，強(qiáng)調(diào)多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)信號(hào)通路，提高藥物治愈率，降低毒副作用[19]。Pei等[20]利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)驅(qū)白巴布期片治療白癜風(fēng)的機(jī)制；陳建麗等[21]利用TCMSP研究復(fù)方柴歸湯對(duì)抑郁癥的機(jī)制；Chen等[22]利用PharmMapper研究丹參酮IIA的作用機(jī)制。目前關(guān)于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用的數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件有TCMSP、TCMID、GEO、Uniprot、Gene Cards等數(shù)據(jù)庫(kù)；DAVID生物信息平臺(tái)、STRING在線軟件、Ctyoscape軟件等。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法及技術(shù)手段，探索當(dāng)歸治療抑郁癥的作用機(jī)制，有利于提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費(fèi)用，為當(dāng)歸的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）、Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、Rx64 3.6.3軟件、Cytoscape_v 3.7.2軟件、String在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）。

2 方法

2.1 當(dāng)歸活性成分的收集、篩選

在TCMSP中檢索當(dāng)歸的活性成分，以生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.05為條件進(jìn)一步篩選活性成分。

2.2 靶點(diǎn)的挖掘及基因名查找

在TCMSP中檢索當(dāng)歸活性成分的靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查找當(dāng)歸活性成分作用靶點(diǎn)的基因名并刪除Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在的基因信息。利用Gene Cards:The Human Gene Database數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘抑郁癥的靶點(diǎn)信息。

2.3 交集靶點(diǎn)和可視化處理

利用R x64 3.6.3軟件中的Venn Diagram將當(dāng)歸作用的靶點(diǎn)和抑郁癥相關(guān)基因取交集，得到當(dāng)歸抗抑郁的潛在靶點(diǎn)，繪制當(dāng)歸—抑郁癥靶點(diǎn)的venn圖；將當(dāng)歸的活性成分及交集靶點(diǎn)信息輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建包含當(dāng)歸活性成分及交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)代表活性成分、靶點(diǎn)基因及蛋白質(zhì)等；節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表相互作用。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

利用String在線數(shù)據(jù)庫(kù)中交集靶點(diǎn)基因的相關(guān)蛋白構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)定為“人”，其余參數(shù)保持默認(rèn)值，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中連線查找核心基因。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用Rx64 3.6.3軟件對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，保存結(jié)果。設(shè)定閾值P＜0.05，篩選排名前20的生物過程和通路，得到富集分析的柱狀圖、氣泡圖及通路圖。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸活性成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以O(shè)B≥30%、DL≥0.05篩選檢索得到當(dāng)歸的27個(gè)活性成分，結(jié)果見表1。

表1 當(dāng)歸的活性成分及靶點(diǎn)信息

續(xù)表1

3.2 當(dāng)歸活性成分作用靶點(diǎn)及相應(yīng)基因名稱

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索當(dāng)歸，并獲得當(dāng)歸的靶點(diǎn)，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查找當(dāng)歸活性成分作用靶點(diǎn)的注釋，結(jié)果見表2。

表2 當(dāng)歸的作用靶點(diǎn)及靶點(diǎn)注釋

3.3 抑郁癥靶點(diǎn)的挖掘

利用Gene Cards得到抑郁癥的靶點(diǎn)共11 478個(gè)。

3.4 當(dāng)歸治療抑郁癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.4.1 當(dāng)歸活性成分-抑郁癥靶點(diǎn)的交集

利用R軟件共得到47個(gè)當(dāng)歸和抑郁癥的共同靶點(diǎn)。包括GABRA1、CHRM3、CHRM2、PTGS2、SLC6A2、MAOB、NCOA2、PTGS1等，交集基因的venn圖，見圖1。

圖1 當(dāng)歸和抑郁癥的交集基因

3.4.2 當(dāng)歸-抑郁癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

構(gòu)建當(dāng)歸活性成分—靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)含337個(gè)節(jié)點(diǎn)，47個(gè)交集靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，26個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，264條相互作用節(jié)點(diǎn)。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

圖2 當(dāng)歸活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.4.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

根據(jù)蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)中基因蛋白之間的連線可得出蛋白之間的相互作用關(guān)系及作用大小，基因蛋白用點(diǎn)表示，蛋白之間存在互作關(guān)系、蛋白之間存在共表達(dá)、蛋白之間存在同源性、基因融合、基因臨界。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中基因臨接的數(shù)目可以判斷出處于核心地位的基因蛋白，并得到基因蛋白的臨接順序，見表3，圖3—圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)視圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)中基因排名

根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心基因包括ACHE、ADRA2A、MAOA、SLC6A4等，其中ACHE的度值較大，與19個(gè)基因存在相互作用關(guān)系。

3.4.4 GO功能富集分析

以P=0.05、q=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)的篩選條件進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)校正的P值列出前20條GO途徑。得到富集分析后的柱狀圖和氣泡圖，圖中顏色越深代表校正后的P值越??；氣泡圖中圓圈的大小代表富集在基因中的數(shù)目。

根據(jù)GO富集分析的結(jié)果顯示當(dāng)歸主要影響：G蛋白偶聯(lián)的胺受體、陽離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體、激素受體、核激素受體及死亡受體等83個(gè)受體活性，達(dá)到治療抑郁癥的目的，見表4，圖5。

圖5 GO功能分析氣泡圖

表4 GO功能富集分析結(jié)果

3.4.5 KEGG通路富集分析

以P=0.05、q=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)的篩選條件進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)校正的P值列出前20條KEGG通路?？梢缘玫礁患治龊蟮闹鶢顖D、氣泡圖和通路圖，通路圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表蛋白或基因或與基因相關(guān)的酶，箭頭代表上下游的關(guān)系，顏色的節(jié)點(diǎn)代表在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的蛋白。根據(jù)KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示影響間隙連接、細(xì)胞凋亡及內(nèi)分泌抵抗力等19個(gè)信號(hào)通路，達(dá)到治療抑郁癥的目的，見表5，圖6—圖7。

圖6 KEGG功能分析氣泡圖

圖7 KEGG通路圖

表5 KEGG通路富集分析結(jié)果

4 討論

當(dāng)歸屬中醫(yī)補(bǔ)血藥，具有補(bǔ)血活血、潤(rùn)腸通便等功效，其復(fù)方用于治療抑郁癥和預(yù)防抑郁癥，具有良好的臨床療效。本研究基于疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)，從分子的角度對(duì)當(dāng)歸抗抑郁的作用機(jī)制進(jìn)行闡述，為當(dāng)歸抗抑郁作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供參考。

本研究篩選得到當(dāng)歸的27個(gè)活性成分，其中26個(gè)成分具有潛在的抗抑郁作用。研究表明阿魏酸可為海馬組織再生提供條件，具有明顯的抗抑郁效果。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示當(dāng)歸中側(cè)柏烯度值最大為19，豆固醇度值為16，洋川芎內(nèi)酯C、D、E度值也較大，表明這18個(gè)活性成分可能是當(dāng)歸治療抑郁癥的核心物質(zhì)，分析結(jié)果見表6。

表6 活性成分及其度值

當(dāng)歸化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示當(dāng)歸抗抑郁具有多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的特點(diǎn)，本研究顯示26種當(dāng)歸活性成分具有抗抑郁的效果，其中部分成分的作用機(jī)制已逐漸明晰，如阿魏酸可促進(jìn)兒茶酚胺（腎上腺素、多巴胺、去甲腎上腺素）結(jié)合[23]，增加了小鼠大腦海馬和額葉皮層中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，在較高劑量的阿魏酸處理后，在下丘腦中也發(fā)現(xiàn)5-羥色胺和去甲腎上腺素增加[24]，Chen等研究也表明阿魏酸增加了小鼠大腦海馬和額葉皮層中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，在較高劑量的阿魏酸處理后，在下丘腦中也發(fā)現(xiàn)5-羥色胺和去甲腎上腺素增加。阿魏酸治療后小鼠海馬和額葉皮質(zhì)中5-HIAA/5-HT比值降低，這阿魏酸使說明神經(jīng)遞質(zhì)代謝減慢，減輕抑郁癥的發(fā)生；藁本內(nèi)酯和樟腦酸均可促進(jìn)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加血液中陰離子濃度，興奮副交感神經(jīng)，可改善無力、易怒、抑郁及焦慮等[25]；吳倩等[26]研究表明藁本內(nèi)酯對(duì)谷氨酸損傷的PC12細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用，該保護(hù)作用與抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流有關(guān)，證明了當(dāng)歸抗抑郁的作用與鈣離子通路有關(guān)；2,6-二（苯基）噻喃-4-硫酮可促進(jìn)雌激素受體的結(jié)合，提高雌激素水平，促進(jìn)多巴胺的釋放，調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)情緒相關(guān)環(huán)路的穩(wěn)態(tài)，在劉亞敏等[27]的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸水提液可顯著增加小鼠海馬組織5-HT和NE、DA、BDNF的含量的含量，側(cè)面證明當(dāng)歸抗抑郁的機(jī)制與其提高海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量有關(guān)；2-戊?；郊姿峥纱龠M(jìn)鈣信號(hào)通路，抑制鈣離子內(nèi)流，增強(qiáng)血液中的鈣離子濃度，降低精神緊張，同樣證明了當(dāng)歸抗抑郁機(jī)制與鈣離子通道密切相關(guān)；洋川芎內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯及豆固醇作用于神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，可與γ-氨基丁酸受體結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)活性配體-受體相互作用，為海馬組織再生提供條件，Z-藁本內(nèi)酯的主要代謝物質(zhì)為洋川芎內(nèi)酯Ⅰ，Z-藁本內(nèi)酯及洋川芎內(nèi)酯Ⅰ可對(duì)于過氧化氫所致的PC12細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用[28-29]；菖蒲二烯促進(jìn)血管平滑肌收縮，升高血壓，引起神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素；7,10-十五碳二炔酸可促進(jìn)花生四烯酸的代謝，降低花生四烯酸的含量，降低大腦超負(fù)荷[30-32]。

富集分析結(jié)果顯示當(dāng)歸與激素受體、核激素受體及死亡受體等83個(gè)受體活性有關(guān)；影響間隙連接、細(xì)胞凋亡及內(nèi)分泌抵抗力等19個(gè)信號(hào)通路。表明當(dāng)歸治療抑郁癥可能促進(jìn)兒茶酚胺（腎上腺素、多巴胺、去甲腎上腺素）釋放、升高激素水平以及增加陰離子濃度；抑制鈣離子內(nèi)流、血壓升高、花生四烯酸的含量降低以及增強(qiáng)神經(jīng)活性配體-受體相互作用等。

本研究?jī)H從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度對(duì)當(dāng)歸抗抑郁的活性成分和可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步的推測(cè)，在抗抑郁的作用機(jī)制方面部分與其他實(shí)驗(yàn)研究一致。但是沒有將當(dāng)歸活性成分的靶點(diǎn)與抑郁癥的靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)地網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，對(duì)以后的研究有一定的局限性，部分結(jié)論未進(jìn)行藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，應(yīng)結(jié)合具體疾病進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)分析，以確保其準(zhǔn)確性和科學(xué)性，為抑郁癥的治療提供最佳方案。