董世榮，馬春雪，賀泓睿

(哈爾濱學(xué)院 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150086)

玉米醇溶蛋白(zein)是玉米中重要的儲(chǔ)藏蛋白[1]，占胚乳蛋白總量的50%以上[2]。玉米醇溶蛋白含有超過(guò)一半的非極性氨基酸，所以不能溶解至純水介質(zhì)，但可以溶解至50%～95%的乙醇水溶液中，而且玉米醇溶蛋白屬于雙親性蛋白質(zhì)，具有很強(qiáng)的自組裝能力，可通過(guò)調(diào)控介質(zhì)極性,誘導(dǎo)其自組裝形成納米顆粒，膠束、纖維、膜等不同的納米結(jié)構(gòu)聚合物[3-5]。反溶劑法是制備玉米醇溶蛋白納米顆粒的常用方法之一，該方法借助于介質(zhì)極性從弱變強(qiáng)時(shí)，玉米醇溶蛋白為避開(kāi)強(qiáng)極性環(huán)境而發(fā)生自組裝聚集形成納米顆粒。玉米醇溶蛋白納米顆粒作為納米運(yùn)載體材料在包封率、穩(wěn)定性和藥物釋放等方面有一定的應(yīng)用，但是由于玉米醇溶蛋白的強(qiáng)疏水性和剛性結(jié)構(gòu)，其形成的納米顆粒對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較差，天然玉米醇溶蛋白納米顆粒運(yùn)載藥物并不理想。通過(guò)酸修飾玉米醇溶蛋白分子可以提高玉米醇溶蛋白分子的柔性[6-8]，進(jìn)而提高玉米醇溶蛋白納米顆粒運(yùn)載小分子藥物的能力。

葉黃素是一種類(lèi)胡蘿卜素，分子量為565 Da，有助于減輕眼部疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性[9]，而且可以作為食品的著色劑[10]，但是葉黃素分子中含有許多共軛雙鍵，屬于異戊二烯類(lèi)聚合物，穩(wěn)定性極差，尤其在酸、氧、高溫、光輻射等條件下均可能發(fā)生降解而失活，使得生物利用程度大幅度降低，降低了葉黃素的利用價(jià)值[11-12]。因此，如果通過(guò)玉米醇溶蛋白納米顆粒對(duì)葉黃素進(jìn)行適當(dāng)?shù)陌襁\(yùn)載，避開(kāi)極端環(huán)境，一定程度上可以提高葉黃素的利用率。

本研究利用酸修飾玉米醇溶蛋白得到柔性玉米醇溶蛋白，利用反溶劑法制備納米顆粒，比較了柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒(FZP)和天然玉米醇溶蛋白納米顆粒(NZP)運(yùn)載葉黃素能力的差異，并且分析了產(chǎn)生這種差異的原因。本研究有望提高葉黃素的利用價(jià)值，并拓寬玉米醇溶蛋白的應(yīng)用范圍。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米醇溶蛋白：購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司；葉黃素：海南利華生物科技有限公司。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇：濟(jì)寧博誠(chéng)化工有限公司；鹽酸：上海禎泰化工有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司；SU8010掃描電鏡 日本日立公司；Nano-ZS納米粒度電位儀 英國(guó)Malvern Panalytical公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)朗儀器有限公司；CD J-815圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品的制備

玉米醇溶蛋白充分分散至80%乙醇中，配制成蛋白濃度為2.5%的溶液。平均分成兩份，一份不做任何處理，另一份調(diào)節(jié)pH至2.0，然后于70 ℃加熱10 h，得到柔性玉米醇溶蛋白，調(diào)節(jié)柔性玉米醇溶蛋白溶液的pH至7.0。將兩份溶液分別分成四等份，然后分別加入最終濃度為0，120，240，360 μg/mL的葉黃素。將這些溶液分別邊攪拌邊緩慢滴加至體積比為2∶5的去離子水中，繼續(xù)攪拌30 min。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，在3000 r/min離心力下離心10 min，獲得載有不同量葉黃素的天然和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒。樣品一部分凍干備用，另一部分以溶液形式儲(chǔ)藏在4 ℃冰箱中備用。

1.4.2 掃描電鏡

采用掃描電鏡觀察凍干的天然玉米醇溶蛋白納米顆粒、柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒、載有葉黃素的柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒。取少量樣品涂抹在雙面導(dǎo)電膠上，噴金，冷凍干燥。在操作電壓為15 kV下觀察納米顆粒的微觀形態(tài)，成像拍照。

1.4.3 粒徑的測(cè)定

將天然和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒溶液分別用去離子水稀釋為3 mg/mL，利用Malvern納米粒度電位分析儀測(cè)定溶液的粒徑大小和強(qiáng)度分布。其中水和樣品的折射率分別為1.33和1.53，測(cè)試溫度為室溫。

1.4.4 納米顆粒對(duì)葉黃素吸附能力的測(cè)定

納米顆粒表面葉黃素含量的測(cè)定：取負(fù)載葉黃素的柔性和天然玉米醇溶蛋白納米顆粒溶液1 mL于試管中，加入10 mL石油醚，輕輕搖晃1 min。靜置30 min后，按照1∶10的比例對(duì)上清液進(jìn)行稀釋。利用石油醚空白調(diào)零，測(cè)定在445 nm條件下的吸光值，并計(jì)算葉黃素含量。

納米顆粒負(fù)載葉黃素總含量的測(cè)定：取負(fù)載葉黃素的柔性和天然玉米醇溶蛋白納米顆粒溶液1 mL于試管中，加入10 mL石油醚，在500 W下超聲15 min。在3000 r/min下離心5 min，按照1∶10的比例稀釋上清液。利用石油醚空白調(diào)零，測(cè)定在445 nm條件下的吸光值，計(jì)算葉黃素總含量。

1.4.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

借助去離子水將天然和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒溶液濃度稀釋成0.1 mg/mL，分別取100 μL樣品置于直徑為0.2 cm的石英比色皿中，在如下參數(shù)下對(duì)樣品進(jìn)行掃描：掃描范圍190～250 nm，掃描速率100 nm/min。用去離子水作為基線，利用儀器自帶軟件對(duì)樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量進(jìn)行計(jì)算。

1.4.6 氨基酸組成的測(cè)定

將天然和柔性玉米醇溶蛋白于110 ℃下在密封管中用6 mol/L HCl水解24 h。使用異硫氰酸苯酯自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸組成，采用儀器廠家推薦的程序進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.4.7 脫酰胺度的測(cè)定

采用苯酚-次氯酸鹽法測(cè)定脫酰胺度[14]。

試劑A的配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g苯酚、25 mg亞硝基鐵氰化鈉，然后加入雙蒸水定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中備用。

試劑B的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 g NaOH并溶于雙蒸水中，移取4.2 mL次氯酸鈉溶液加入到NaOH溶液中，并定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中備用。

準(zhǔn)確移取5.0 mL試劑A于試管中，加入20 μL不同濃度的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為0.1，0.4，0.6，0.8，1.0 μg/L)或者待測(cè)樣品，充分振蕩、混勻。然后準(zhǔn)確移取5.0 mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻。迅速轉(zhuǎn)移至水浴鍋中，在37 ℃下水浴顯色20 min，然后冷卻至室溫，在625 nm處測(cè)定溶液的吸光值，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

根據(jù)所測(cè)定的樣品游離氨含量及總酰胺含量，計(jì)算脫酰胺度：

1.4.8 分子柔性的測(cè)定

以蛋白質(zhì)對(duì)胰蛋白酶的敏感度表征分子柔性[15]，取250 μL的1 mg/mL酶液(0.05 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液)加入到4 mL濃度為1 mg/mL的脫酰胺修飾后的玉米醇溶蛋白溶液(蛋白質(zhì)量和酶質(zhì)量比值為16∶1)，38 ℃水浴恒溫5 min，反應(yīng)結(jié)束后加入4 mL的5%三氯乙酸終止反應(yīng)，離心后取上清液測(cè)定其在280 nm下的吸光度，用吸光度A表征量化柔性的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 微觀形態(tài)的分析

將天然玉米醇溶蛋白和柔性玉米醇溶蛋白分別分散在80%乙醇水溶液中，然后利用反溶劑法誘導(dǎo)蛋白質(zhì)自組裝形成聚合物，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 玉米醇溶蛋白納米顆粒的微觀形態(tài)

由圖1可知，天然玉米醇溶蛋白形成的納米顆粒分布更加致密，而柔性玉米醇溶蛋白的納米顆粒分布更加有序，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。將葉黃素與柔性玉米醇溶蛋白復(fù)合后仍然可以形成球狀納米顆粒，說(shuō)明葉黃素的添加并沒(méi)有抑制納米顆粒的形成，與韓赫等得出的添加葉黃素后玉米醇溶蛋白仍然可以形成球狀納米顆粒的結(jié)果相一致。

2.2 納米顆粒對(duì)葉黃素吸附量的影響

將濃度梯度為0.02，0.04，0.08，0.16，0.24，0.32 μg/mL的葉黃素溶液，在最大吸收波長(zhǎng)445 nm處測(cè)定吸光值，制備葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

經(jīng)過(guò)繪制和計(jì)算，葉黃素含量和吸光值的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=2.7526x+0.0835(R2=0.9980)，說(shuō)明葉黃素含量和吸光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒對(duì)葉黃素的吸附能力高于天然玉米醇溶蛋白納米顆粒對(duì)葉黃素的吸附能力(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 天然和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒對(duì)葉黃素的吸附能力

由圖3可知，在天然玉米醇溶蛋白和柔性玉米醇溶蛋白溶液中分別添加相對(duì)蛋白質(zhì)含量為4.8%、9.6%、14.4%的葉黃素時(shí)，天然玉米醇溶蛋白納米顆粒表面葉黃素的含量分別為0.461，0.569，0.629 μg/mL，柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒表面葉黃素的含量分別為0.527，0.672，0.781 μg/mL。納米顆粒中表面葉黃素含量和總含量存在較大區(qū)別(P<0.05)。在天然玉米醇溶蛋白納米顆粒中葉黃素添加量相對(duì)蛋白質(zhì)含量為4.8%、9.6%、14.4%時(shí)，天然玉米醇溶蛋白納米顆?？?cè)~黃素的含量分別為1.411，1.319，1.64 μg/mL，柔性玉米醇溶蛋白納米顆?？?cè)~黃素的含量分別為1.58，1.472，1.884 μg/mL。酸修飾后的玉米醇溶蛋白會(huì)發(fā)生一定程度的水解和脫酰胺作用[16]，進(jìn)而增加了玉米醇溶蛋白的雙親性，所以酸修飾的玉米醇溶蛋白具有更多的與葉黃素結(jié)合的位點(diǎn)。

2.3 納米顆粒粒徑分析

天然玉米醇溶蛋白納米顆粒和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒的粒徑強(qiáng)度和顆粒大小存在不同，見(jiàn)圖4。

圖4 天然和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒粒徑大小和強(qiáng)度分布

由圖4可知，柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒的強(qiáng)度呈現(xiàn)典型的單峰分布，而天然玉米醇溶蛋白在粒徑較大的范圍出現(xiàn)另一個(gè)小峰。柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒的平均粒徑(d=101.01 nm)小于天然玉米醇溶蛋白納米顆粒的平均粒徑(d=111.95 nm)，而且二者的多分散系數(shù)(PDI)分別為0.14和0.22，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果可靠性較高。粒徑越小，說(shuō)明其表面積越大，進(jìn)而表現(xiàn)出較好的吸附能力。

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圓二色光譜是分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的重要方法[17]。由圖5可知，天然玉米醇溶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)明顯不同于柔性玉米醇溶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(P<0.05)。與天然玉米醇溶蛋白相比較，柔性玉米醇溶蛋白的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量增加，但α-螺旋含量和β-轉(zhuǎn)角含量降低。Mattice等[18]發(fā)現(xiàn)經(jīng)乙酸水溶液處理，zein的α-螺旋結(jié)構(gòu)占比下降，分子間β-折疊上升。這可能是由于蛋白質(zhì)中的α-螺旋變?yōu)棣?折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變得疏松和無(wú)序化，蛋白質(zhì)分子的無(wú)序化使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得靈活[19]，從而促進(jìn)玉米醇溶蛋白與葉黃素的結(jié)合。

圖5 天然和柔性玉米醇溶蛋白的圓二色光譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的比較

2.5 氨基酸組成分析

玉米醇溶蛋白中氨基酸殘基主要是天冬酰胺和谷氨酰胺，通過(guò)脫酰胺反應(yīng)轉(zhuǎn)化為天冬氨酸和谷氨酸。在酸修飾玉米醇溶蛋白過(guò)程中發(fā)生了脫酰胺反應(yīng)，脫酰胺度為5.48%(見(jiàn)表1)。脫酰胺反應(yīng)可以提高玉米醇溶蛋白的分子柔性[20]。通過(guò)玉米醇溶蛋白分子對(duì)胰蛋白酶的敏感度表征分子柔性。

表1 天然和柔性玉米醇溶蛋白氨基酸和脫酰胺度的變化

由表1可知，酸修飾玉米醇溶蛋白的分子柔性比天然玉米醇溶蛋白的分子柔性提高了240%。柔性玉米醇溶蛋白和天然玉米醇溶蛋白的氨基酸組成也存在很大的差異。蛋白質(zhì)中包括酸性氨基酸、堿性氨基酸和中性氨基酸，還包括疏性水氨基酸和親水性氨基酸。天然玉米醇溶蛋白中的谷氨酰胺和天冬酰胺的含量為3.45%，而經(jīng)過(guò)酸修飾后的玉米醇溶蛋白分子中含量降低至1.71%。堿性氨基酸的含量也存在顯著差異(P<0.05)，天然和柔性玉米醇溶蛋白中的含量分別為25.35%和1.97%，而疏水性氨基酸含量分別為51.99%和14.22%。玉米醇溶蛋白分子是一個(gè)內(nèi)部含有9～10個(gè)以反平行方式排列的螺旋段的13 nm×1.2 nm×3 nm大小的棱鏡模型，螺旋兩端由富含谷氨酰胺的橋連接。脫酰胺反應(yīng)使谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，破壞了螺旋結(jié)構(gòu)，從而使得α-螺旋含量降低。脫酰胺反應(yīng)改變了蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)而改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和分子間相互作用，增加了蛋白質(zhì)分子的無(wú)序性，有利于玉米醇溶蛋白和葉黃素的吸附結(jié)合。

3 結(jié)論

酸誘導(dǎo)玉米醇溶蛋白發(fā)生了脫酰胺反應(yīng)，提高了分子柔性。利用反溶劑法制備的天然和柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒對(duì)葉黃素的運(yùn)載能力明顯不同。柔性玉米醇溶蛋白納米顆粒表面或總?cè)~黃素的含量均高于天然玉米醇溶蛋白負(fù)載葉黃素的含量。葉黃素添加量相對(duì)蛋白質(zhì)含量為4.8%時(shí)，柔性和天然玉米醇溶蛋白表面葉黃素的含量分別為0.527，0.461 μg/mL，總?cè)~黃素含量分別為1.58，1.411 μg/mL。柔性玉米醇溶蛋白分子中α-螺旋含量降低，無(wú)規(guī)則卷曲含量增加，蛋白質(zhì)分子的無(wú)序化有利于蛋白質(zhì)與葉黃素的吸附，而且柔性玉米醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變歸因于酸誘導(dǎo)脫酰胺反應(yīng)改變了氨基酸組成成分。