續(xù)釗，盧前明

(1.鄭州職業(yè)技術學院，鄭州 450121；2.河南工程學院 資源與安全工程學院，鄭州 451191)

發(fā)酵類食品是通過微生物作用食品而制成，在我國具有豐富的歷史文化[1-2]。在我國古代，發(fā)酵是人們保存食物的一種傳統(tǒng)方法[3]，隨著發(fā)酵工藝經(jīng)過無數(shù)次的演變和傳承，形成了我國獨特的中國食品發(fā)酵工藝[4-5]。我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品種類多樣，包括發(fā)酵谷類食品[6]、發(fā)酵蔬菜類食品[7]、發(fā)酵豆類食品以及其他與發(fā)酵相關的肉類制品[8-9]、乳品和酒類[10]。由于發(fā)酵食品具有獨特的風味，自古以來就深受我國人民的喜愛，并隨著國際之間的交流，對很多國家也產(chǎn)生了不小的影響[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究結(jié)果也表明，適當食用發(fā)酵食品對身體具有保健功效。

酸菜在發(fā)酵時，主要分為3個步驟[12]：發(fā)酵的前期，以需氧型微生物發(fā)酵為主，隨著發(fā)酵過程的進行，酸菜中的氧氣逐漸被消耗為無氧的環(huán)境；發(fā)酵中期，以乳酸菌發(fā)酵為主要的發(fā)酵方式，此發(fā)酵過程中，乳酸菌產(chǎn)生大量的乳酸，導致發(fā)酵液中的pH值迅速下降；最后，以乳酸菌中的短乳酸桿菌發(fā)酵為主，形成泡菜中的多種風味物質(zhì)，此階段是泡菜中風味物質(zhì)形成的主要階段。

先前的一些研究人員主要采用分離、純化和鑒定的方法，對酸菜中的微生物進行鑒定，不僅消耗大量的時間，而且培養(yǎng)的過程中也極易受到環(huán)境因素的影響，不能夠正常地反映出酸菜中細菌多樣性的情況，結(jié)果的可靠性也較差。近些年，隨著分子生物技術的發(fā)展和進步，也為分析復雜的微生物群落提供了先進的技術和手段。

發(fā)酵酸菜是在低濃度食鹽的條件下，利用微生物發(fā)酵而制成的一種蔬菜食品[13]。酸菜營養(yǎng)豐富且具有獨特的風味，同時也具有開胃健脾等生物學功能[14]。一般用于發(fā)酵的蔬菜表面具有大量的微生物，如果發(fā)酵方法不規(guī)范[15]，可能會導致一些對人體有害的微生物混入發(fā)酵酸菜中。本研究基于此條件，利用分子生物學手段，對不同發(fā)酵階段酸菜中所含的微生物種類多樣性進行研究，旨在為酸菜的標準化和規(guī)范化生產(chǎn)提供一個基礎理論[16]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設備

白菜：購于當?shù)爻?；食鹽：無碘鹽深井礦鹽350 g袋裝；干酪乳酸桿菌：中國微生物研究所提供。

全自動機械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐 無錫興順生物科技有限公司；PCR基因擴增儀 上海泰坦科技股份有限公司；電子天平 山東歐萊博儀器有限公司；pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；電泳儀、臺式離心機 濟南童鑫生物科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；ZD-9560水平脫色搖床 常州市凱航儀器有限公司；DZKW-A電熱恒溫水浴鍋 北京京創(chuàng)泰寧偉業(yè)科技發(fā)展有限公司；SHPY-70F生化培養(yǎng)箱 深圳市澳德瑪電子科技有限公司；干燥箱 鶴壁市鑫誠信儀器儀表有限公司；超凈工作臺 蘇州安泰凈化有限公司；超低冰箱 日本三洋公司；顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司；移液槍 德國Ependoff公司。

1.2 試驗所需引物

試驗過程中所需要的引物均由上海生物科技有限責任公司合成，見表1。

表1 發(fā)酵酸菜中微生物測序所需引物

1.3 培養(yǎng)基制作

1.3.1 MRS培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨8 g，酵母浸膏粉4 g，磷酸二氫鉀 2 g，檸檬酸銨3 g，乙酸鈉 3 g，葡萄糖18 g，硫酸鎂1 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 6～7，121 ℃滅菌20 min[17]。

1.3.2 YPD培養(yǎng)基

葡萄糖18 g，酵母粉8 g，蛋白胨18 g，瓊脂18 g，pH 6～7，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min[18]。

1.3.3 PDA培養(yǎng)基

土豆200 g，葡萄糖18 g，磷酸二氫鉀 2 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂18 g，pH 6～7，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min[19]。

1.4 試劑盒

Ezup柱式細菌基因組DNA試劑盒，瓊脂糖DNA回收試劑盒。

1.5 自然發(fā)酵腌菜制作流程

選取優(yōu)質(zhì)白菜→晾曬→食鹽→裝罐發(fā)酵→腌菜。

選取優(yōu)質(zhì)菜，晾曬3 d，去除變黃的菜葉，用清水清洗干凈，將清洗好的白菜放于發(fā)酵罐中并進行密封，添加1%～1.5%濃度的食鹽，控制發(fā)酵罐溫度為15～20 ℃，每間隔2 d取1次樣本，連續(xù)取30 d樣本[20]。

1.6 菌株的分析純化及計數(shù)

在發(fā)酵過程中，每間隔2 d取出發(fā)酵液體的20 mL樣品，在超凈工作臺上分別稀釋10，100，1000，10000倍，分別涂布于MRS、YPD和PDA 3種培養(yǎng)基上，每個稀釋濃度分別涂布3個平板，然后檢測菌落的個數(shù)。

1.7 形態(tài)學鑒定

將MRS、YPD和PDA 3種培養(yǎng)基上分離獲得的菌落進行劃分，對形態(tài)純化獲得的菌株進行顯微鏡形態(tài)特征的觀察(菌落的大小、形態(tài)、直徑和光澤)。

1.8 樣品中DNA的提取

按照Ezup柱式細菌基因組DNA試劑盒上所攜帶的說明書進行操作。

1.9 16S rDNA分析

分離純化后的菌株進行形態(tài)學鑒定之后，將待測菌株進一步利用16S rDNA的序列進行對比和分子水平鑒定。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建流程：將獲得的序列放置于NCBI中和數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，比對之后，確定大致類群；從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載該類群的所有數(shù)據(jù)，將獲得的數(shù)據(jù)與這些數(shù)據(jù)進行合并，合并之后的數(shù)據(jù)上傳至MAFFT網(wǎng)站，對數(shù)據(jù)進行排序；將排好順序的系列上傳至Cipres網(wǎng)站，利用網(wǎng)站建立最大簡約樹，最后進行物種親緣關系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離純化

由表2可知，隨著發(fā)酵時間的增長，自然發(fā)酵的酸菜中微生物多樣性先增加后不變，其中3種不同培養(yǎng)基最后分離出的菌株數(shù)量也不相同。MRS培養(yǎng)基中分離獲得7個菌株，YPD培養(yǎng)基中分離獲得4個菌株和PDA培養(yǎng)基中分離獲得3個菌株，分離效果分別為MRS培養(yǎng)基>YPD培養(yǎng)基>PDA培養(yǎng)基。

表2 自然發(fā)酵酸菜中分離純化的菌株種類統(tǒng)計

2.2 形態(tài)學鑒定

從MRS、YPD和PDA 3種培養(yǎng)基上一共分離出14個菌株，分別觀察形狀、大小,是否有隆起,表面是否光滑、有光澤和顏色。

由表3可知，所有分離出來的細菌都呈現(xiàn)乳白色，細菌大小均小于1 mm，形狀主要為圓形和近圓形，根據(jù)形態(tài)特征鑒定大致可以分為乳酸桿菌、不動桿菌、酵母菌和大腸桿菌4大類，結(jié)果表明自然發(fā)酵的酸菜中微生物多樣性豐富。

表3 分離純化菌株菌落形態(tài)

2.3 16S rDNA 鑒定

對上述的14個菌株進行16S rDNA鑒定，利用細菌基因組的DNA抽提試劑盒進行基因組DNA的抽提，在提取的DNA中加入正、反向引物，經(jīng)PCR測量，將獲得的PCR產(chǎn)物送至上海生物科技有限責任公司進行測序。獲得原始序列后，將原始系列在BioEdit軟件上進行檢查和拼接，將拼接后得到的系列放入NCBA數(shù)據(jù)系統(tǒng)進行Blast比對，大致確定微生物的類群之后，下載該類群的相關物種序列，進行物種多樣性分析。

表4 分離菌株Blast比對結(jié)果

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相關的數(shù)據(jù)，使用MAFFT進行數(shù)據(jù)的排齊，在BioEdit中進行手動編輯，剪出多余和不合格的序列。把整理好的數(shù)據(jù)集上傳至Cpries網(wǎng)站，建立最大簡約樹，見圖1。

圖1 利用最大簡約樹表示自然發(fā)酵的酸菜中微生物的多樣性

由圖1可知，自然發(fā)酵的酸菜中主要分為3大類：乳酸桿Lactobacillus菌類、芽孢桿菌Esherichia類和酵母菌Candida類。其中乳酸桿菌為自然發(fā)酵酸菜中的主要類群，占11/14，酵母菌和芽孢桿菌都占有較低的比例，二者所占的比例為2/14。

3 小結(jié)

發(fā)酵酸菜具有營養(yǎng)豐富、風味獨特和開胃健脾等特點。目前，酸菜的發(fā)酵主要是家庭式小規(guī)模生產(chǎn)，存在發(fā)酵時間長、產(chǎn)量不穩(wěn)定等諸多因素。為了人們的健康，本研究主要利用形態(tài)學和分子生物學手段對自然發(fā)酵酸菜中的微生物多樣性進行研究，研究結(jié)果表明，自然發(fā)酵的酸菜中，乳酸桿菌的種類占有主導優(yōu)勢，其次為酵母菌和芽孢桿菌。