肖冉，惠明,*，田青，黃繼紅

(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，鄭州 450001；2.工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450001)

Kefir是一種源于北高加索地區(qū)風(fēng)味獨(dú)特的含酒精低熱量、低乳糖發(fā)酵乳飲品[1-3]，由于其多菌種協(xié)同發(fā)酵并且有酒味的特點(diǎn)，也被譽(yù)為發(fā)酵乳中的香檳[4-5]。Kefir目前在市場上還不常見，雖然有個(gè)別產(chǎn)品也標(biāo)明是“開菲爾”，但從其發(fā)酵菌種及產(chǎn)品特色來看，與傳統(tǒng)意義上的Kefir相差甚遠(yuǎn)。常見的Kefir發(fā)酵劑被稱為Kefir粒，其中微生物菌相復(fù)雜。有研究表明，Kefir粒中酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等占主導(dǎo)地位[6-8]。也正因如此，發(fā)酵條件略有不同就可能造成不同批次的Kefir乳風(fēng)味及狀態(tài)不穩(wěn)定、CO2產(chǎn)氣量過多、易脹袋、營養(yǎng)成分差異大等問題[9-10]。因此，本文嘗試以牛乳為主要原料，通過接種自選酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等不同配比的優(yōu)勢(shì)菌劑模擬發(fā)酵制備Kefir乳，并借助感官品評(píng)、理化分析及SPME-GC-MS技術(shù)等來考察不同菌種之間的比例及相互協(xié)同作用，各自代謝物對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)形成、產(chǎn)品特性的影響等，以期為下一步的Kefir產(chǎn)品開發(fā)、品質(zhì)控制及市場普及提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌L1(簡稱L1)、酵母菌TN1(簡稱TN1)、醋酸桿菌A3(簡稱A3)：均由工業(yè)微生物菌種保藏與選育河南省工程實(shí)驗(yàn)室篩選和提供。

1.1.2 原料及試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖：北京奧博興生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、乙酸鈉、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、氫氧化鈉、酚酞：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；純牛奶：內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；白砂糖：鄭州市大型連鎖超市。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[11]，YPD培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[12]。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；Trace 1300 GC/MS聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器(SPME手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭)、DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管色譜柱 江蘇默克儀器有限公司；ZQZY-CS全溫恒溫培養(yǎng)搖床、ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 美國Stable Micro System公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基礎(chǔ)發(fā)酵試驗(yàn)

菌種活化：A3和L1菌株用MRS液體培養(yǎng)基活化；TN1菌株用YPD液體培養(yǎng)基活化。

發(fā)酵試驗(yàn)：取若干100 mL錐形瓶分別添加50 mL純牛奶、2.5 g白砂糖，經(jīng)巴氏殺菌(62 ℃，30 min)后放涼，接種7%的發(fā)酵劑，混勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h至發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱后熟過夜[13]。發(fā)酵中考察不同的菌種配比組合：A(L1+TN1)、B(L1+A3)、C(A3+TN1)，其中：L1菌數(shù)為4.1×108CFU/mL，TN1菌數(shù)為8.1×107CFU/mL，A3菌數(shù)為2.9×108CFU/mL。

1.3.2 發(fā)酵乳菌種添加比例的單因素試驗(yàn)

經(jīng)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，醋酸桿菌A3及釀酒酵母TN1單一菌種發(fā)酵牛奶產(chǎn)品均不具備酸奶的品質(zhì)，因此先進(jìn)行A3、L1、TN1兩兩不同比例組合試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化三菌種組合，借以考察復(fù)合菌種發(fā)酵產(chǎn)品的感官特征及風(fēng)味物質(zhì)種類，基本方案如下：

將活化后的A組(L1+TN1)按照1∶0.05、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20、1∶0.25的比例、B組(L1+A3)按照1∶0.40、1∶0.60、1∶0.80、1∶1.00、1∶1.20的比例和C組(A3+TN1)按照1∶0.05、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20、1∶0.25的比例分別接種于已殺菌的牛奶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h至發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱后熟過夜。以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，確定A組、B組、C組較佳的添加比例。

1.3.3 發(fā)酵乳菌種添加比例的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面優(yōu)化方法參考文獻(xiàn)[14-16]。通過單因素試驗(yàn)確定了A組、B組、C組的最佳水平范圍，在此基礎(chǔ)上利用Design-Expert 12.0 軟件制作Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化后的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并與預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，確定三菌種混合發(fā)酵制備Kefir的最佳發(fā)酵劑比例。

1.3.5 發(fā)酵乳pH測(cè)定

發(fā)酵乳pH按照文獻(xiàn)[17]的方法測(cè)定。

1.3.6 滴定酸度測(cè)定

發(fā)酵乳滴定酸度按照文獻(xiàn)[18]的方法測(cè)定。

1.3.7 發(fā)酵乳持水率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取20 g后熟后的酸乳，置于50 mL離心管中，在4 ℃條件下從3800 r/min離心20 min后除上清液，稱剩余沉淀物質(zhì)量[19]，按式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.8 發(fā)酵乳乳清析出量測(cè)定

將30 g酸乳樣品，在4 ℃以12000 r/min條件下離心20 min，收集濾出的乳清[20]，按式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.9 GC-MS比較不同發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的變化

取酸奶樣品3 g 緩慢加入到100 mL的錐形瓶中，加入21 mL飽和食鹽水，吸取20 μL的0.09 g/L內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇)加入樣品，密封嚴(yán)密。平衡時(shí)間10 min，溫度45 ℃，萃取45 min，解吸3 min后進(jìn)行檢測(cè)。

GC條件：采用程序升溫方式，由常溫升至40 ℃，保持1 min,以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至210 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度215 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；分流比20∶1進(jìn)樣。

MS條件：電離方式EI，70 eV；離子源溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～450 amu；發(fā)射電流100 μA，檢測(cè)電壓1.4 kV[21]。

1.3.10 不同酸奶的質(zhì)構(gòu)分析

將優(yōu)化組(L1TN1A3)與L1樣品于 4 ℃冰箱中后熟過夜后取出，進(jìn)行對(duì)比分析[22]。采用TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品質(zhì)構(gòu)參數(shù)。采用 TPA 模式測(cè)試，選用P/50探頭，測(cè)試距離為25 mm，觸發(fā)點(diǎn)為 5.0 g，測(cè)前速度為2 mm/s，測(cè)中速度為 2 mm/s,測(cè)后速度為6 mm/s。測(cè)定指標(biāo)包括硬度、回彈性、內(nèi)聚性、黏性、咀嚼性、彈力。

1.3.11 發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)由五部分組成，由10名成員進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果取平均值，本評(píng)定均在自然光下室溫狀態(tài)觀察發(fā)酵乳的組織狀態(tài)、色澤及氣味，用溫水漱口后品嘗酸奶樣品。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖和統(tǒng)計(jì)分析，IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行顯著性分析，Design Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種試驗(yàn)菌株的形態(tài)

3株制備Kefir乳的出發(fā)菌株見圖1。

圖1 各發(fā)酵菌株菌落形態(tài)

2.2 單因素試驗(yàn)

通過感官評(píng)分得出A、B、C組的最優(yōu)添加比例。隨著A添加比例的增加，在1∶0.10時(shí)感官評(píng)分最高，添加量增加到1∶0.25時(shí)氣泡過多，酒精味過重，殺口感過于刺激，評(píng)分最低，見圖2中A。隨著B添加比例的增加，在1∶0.40時(shí)感官評(píng)分逐漸上升，在1∶1.00時(shí)達(dá)到最佳，添加量增大到1∶1.20時(shí)感官評(píng)分下降，酸奶味道過酸，引起評(píng)價(jià)人員口感不適，見圖2中B。C添加比例為1∶0.05時(shí)發(fā)酵口感不豐富，酸味不重，無酵母發(fā)酵的酒精及氣泡帶來的殺口感，添加比例增加為1∶0.20時(shí)感官評(píng)分最高，酸甜適中，氣泡帶來的殺口感適中，品嘗時(shí)清爽利口，而添加量增大到1∶0.25時(shí)感官評(píng)分下降，酸奶殺口感過于濃烈，引起評(píng)價(jià)人員口感不適，見圖2中C。

圖2 不同菌種比例組合發(fā)酵產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

在考察了A、B、C比例的基礎(chǔ)上，在 37 ℃下，白砂糖添加量為2.5 g，接種量為7%，發(fā)酵12 h，采用Design Expert 12.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)并進(jìn)行分析，結(jié)果見表3與表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

利用Design Expert 12.0軟件，以響應(yīng)值為感官評(píng)分，A(L1∶TN1)、B(L1∶A3)、C(A3∶TN1)為自變量，擬合得到回歸方程為：

Y=85.638+0.21125A+0.34875B+0.44C-0.3825AB+0.04AC+0.47BC-2.32775A2-2.09275B2-2.71525C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，本試驗(yàn)所選模型回歸方程P<0.01，模型顯著。BC(P<0.05)交互作用達(dá)到顯著，二次項(xiàng)A2、B2及C2(P<0.01)達(dá)到極顯著，對(duì)發(fā)酵乳感官評(píng)分有極顯著影響。各因素對(duì)Kefir感官評(píng)分的影響程度為C>B>A。失擬項(xiàng)P>0.05代表模擬函數(shù)與真實(shí)函數(shù)擬合度好，說明此方程可以取得較滿意的試驗(yàn)結(jié)果。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

控制單個(gè)因素不變，分析其他因素的交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響。采用Design Expert 12.0軟件處理數(shù)據(jù)，作出不同組合的兩兩因素交互的響應(yīng)面圖，見圖3。

圖3 不同組合之間交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響

響應(yīng)面優(yōu)化得到的適宜比例組合A的比例為1∶0.098，B的比例為1∶0.982，C的比例為1∶0.155。將不同菌種組合的優(yōu)化比例相加得到適宜的L1∶TN1∶A3三菌混合發(fā)酵的比例為2.00∶0.25∶1.99。為方便以后企業(yè)及家庭的批量使用，建議采用L1∶TN1∶A3為2.0∶0.3∶2.0的比例進(jìn)行三菌種混合發(fā)酵。為驗(yàn)證在優(yōu)化條件下Kefir口味是否達(dá)到最佳，重復(fù)3次試驗(yàn)，三菌混合發(fā)酵酸奶的感官評(píng)分達(dá)到87.9分，說明梯次優(yōu)化菌種比例制備Kefir具有可行性。

2.5 理化指標(biāo)分析結(jié)果

為校驗(yàn)上述優(yōu)化試驗(yàn)感官分析的實(shí)際效果，分別采用L1(單菌)、A組、B組、C組及優(yōu)化組(L1+TN1+A3)等菌種比例組合按前述培養(yǎng)條件開展對(duì)照發(fā)酵試驗(yàn)并檢測(cè)相應(yīng)理化指標(biāo)，結(jié)果見表5。

表5 不同處理組發(fā)酵乳的理化指標(biāo)比較

由表5可知，發(fā)酵終點(diǎn)B組的pH值較低，滴定酸度最高，由于乳酸菌和醋酸桿菌共同發(fā)酵，生成乳酸及乙酸量過高。L1發(fā)酵組持水率最大，C組乳清析出率最高，基本分析如下：單菌L1組發(fā)酵乳持水率顯著大于其他發(fā)酵組，優(yōu)化組最低，可能是由于添加酵母菌組發(fā)酵乳糖產(chǎn)生的乙醇破壞了酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，引起了發(fā)酵乳凝膠穩(wěn)定性下降，持水率降低；而乳清析出是酸奶的一種不良特性，其中C組乳清析出率較大，其次為優(yōu)化組，可能是由于混菌發(fā)酵有機(jī)酸種類豐富[23]，從pH、滴定酸度也可以看出，酸度過高更容易接近酪蛋白的等電點(diǎn)，使酸凝固加強(qiáng)，造成乳清析出過多；另外，其他發(fā)酵組也有不同的產(chǎn)酸、凝聚及乳清析出現(xiàn)象，表現(xiàn)出不同菌種發(fā)酵因產(chǎn)物差異引起凝乳狀態(tài)發(fā)生改變的現(xiàn)象，這一點(diǎn)在前述的感官評(píng)定及隨后的質(zhì)構(gòu)分析及風(fēng)味成分分析中也可以看出。

2.6 質(zhì)構(gòu)分析

將優(yōu)化組與L1組酸奶進(jìn)行質(zhì)構(gòu)的對(duì)比分析，評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括：硬度、回彈性、內(nèi)聚性等方面。L1組酸奶與優(yōu)化組酸奶的硬度分別為262.64 g 和294.76 g(見表6)。與L1組相比，優(yōu)化組可顯著提高酸奶硬度，相比L1組酸奶硬度提高了12.23%，黏性增加了57.02%，嚼勁增加了33.59%，這可能與蛋白質(zhì)基質(zhì)和 TN1、A3之間發(fā)生靜電相互作用，形成靜電復(fù)合物，從而產(chǎn)生致密網(wǎng)絡(luò)有關(guān)[24]。此外，優(yōu)化組顯著降低了酸奶的回彈性，與L1組相比，降低了14.74%、內(nèi)聚性升高了38.10%，彈力增加了75%，由于優(yōu)化組的硬度較L1組高，對(duì)其施加的彈力變大，其回彈性就會(huì)降低，恢復(fù)到原來形狀的能力降低了14.74%。這可能是由于添加醋酸菌使酸奶酸度升高，造成蛋白質(zhì)內(nèi)聚性和黏性增強(qiáng)，脫羧化作用對(duì)質(zhì)地及物理特性有負(fù)面影響，但綜合評(píng)價(jià)，添加酵母菌及醋酸菌會(huì)對(duì)改善酸奶風(fēng)味、增加市場酸奶花色有重大意義。

表6 L1組與優(yōu)化組對(duì)酸乳質(zhì)構(gòu)的影響

2.7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較

采用固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)優(yōu)化組混合發(fā)酵的Kefir、L1組單菌發(fā)酵的酸奶和空白對(duì)照牛奶進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)分析，各組樣品揮發(fā)性物質(zhì)種類雷達(dá)圖見圖4。

圖4 各處理組揮發(fā)性物質(zhì)種類的雷達(dá)圖

3種乳中檢測(cè)到的風(fēng)味物質(zhì)共有45種，酮醛類化合物7種、酯類14種、醇類6種、酸類12種、烷烴化合物3種及其他類3種。優(yōu)化組比單菌發(fā)酵組增加了13種風(fēng)味物質(zhì)，風(fēng)味物質(zhì)種類及相對(duì)含量見表7。

表7 兩種發(fā)酵乳與CK組GC-MS風(fēng)味物質(zhì)種類及相對(duì)含量

檢測(cè)到的典型的芳香化合物是由牛奶中的主要成分蛋白質(zhì)、乳糖和脂類通過一系列代謝途徑(如脂類分解、蛋白水解和糖酵解)產(chǎn)生[25]。乳酸菌將乳糖分解為單糖，進(jìn)一步生成乳酸，并為酵母菌和醋酸菌生長提供碳源，促進(jìn)酒精發(fā)酵生成乙醇、CO2、有機(jī)酸和醛類等特殊風(fēng)味物質(zhì)[26]。優(yōu)化組主要檢測(cè)出苯乙烯、水楊酸辛酯、2-甲基丙醇，L(-)-乳酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊酸、苯甲酸、辛酸乙酯其他兩組不生成的特殊物質(zhì)。辛酸乙酯和異戊酸是優(yōu)化組產(chǎn)生的特有的風(fēng)味物質(zhì)，增加了酸奶花果香[27]。乳酸乙酯是由乳酸與酵母菌的產(chǎn)物乙醇生成的新產(chǎn)物。苯乙烯可能是在儲(chǔ)存期間從包裝材料遷移到酸奶中[28]。在酵母菌參與下將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇，生成麥芽香氣的物質(zhì)——2-甲基丙醇，賦予Kefir特有的柔和醇香[29]。同時(shí)，優(yōu)化組中的苯乙醇和異戊醇兩種高級(jí)醇含量較高，分別賦予了Kefir發(fā)酵乳制品中典型的玫瑰香氣及果香。2-甲基丙醇、苯乙醇和異戊醇3種醇類在普通酸乳中極少檢出[30]。2-壬酮、2-庚酮、壬醛、辛酸和乙偶姻等含量顯著增多，增加了奶油味。另外，優(yōu)化組中己醛含量降低，有利于改善奶中的“豆腥味”，證明優(yōu)化組更加適口，具有傳統(tǒng)Kefir粒發(fā)酵酸乳而普通酸奶不具備的特殊風(fēng)味。

3 結(jié)論

選擇Kefir的主發(fā)酵菌種植物乳桿菌L1、酵母菌TN1、醋酸桿菌A3開展單因素試驗(yàn)，得到混菌發(fā)酵配比A(L1∶TN1)組比例為1∶0.098、B(L1∶A3)組為1∶0.982、C(A3∶TN1)組為1∶0.155；在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定L1∶TN1∶A3三菌混合發(fā)酵的適宜比例為2.0∶0.3∶2.0。優(yōu)化組菌種組合改善了添加酵母菌后發(fā)酵乳產(chǎn)氣多、有辛辣及殺口感的現(xiàn)象；隨后用固相微萃取及氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)優(yōu)化組及相關(guān)試驗(yàn)組進(jìn)行了揮發(fā)性成分分析，檢測(cè)到的主要風(fēng)味物質(zhì)共有45種，其中異戊醇、苯乙醇、2-甲基丙醇、乳酸乙酯等是Kefir中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，其中己醛含量的減少更是改善了牛奶及普通酸奶的口感。本試驗(yàn)為后續(xù)的Kefir 發(fā)酵工藝優(yōu)化及發(fā)酵乳中各菌種之間的協(xié)同代謝及凝乳結(jié)構(gòu)的變化奠定了基礎(chǔ)。