張 玉 張 帥 林穎悅

河南文正檢測技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450048

蛋白質(zhì)組，通俗理解為特定的條件機理中，存在于有機體中的蛋白質(zhì)種類與數(shù)量總和。對這些存在于生命體內(nèi)的蛋白質(zhì)種類與數(shù)量總和進行深入研究，包括對蛋白質(zhì)組的特性、蛋白質(zhì)組的組成結(jié)構(gòu)以及在不同的條件機理中蛋白質(zhì)組的變化規(guī)律等現(xiàn)象進行研究的學科，即為蛋白質(zhì)組學（proteomics）。除此之外，為了研究蛋白質(zhì)組而創(chuàng)造的相關(guān)技術(shù)，也能夠被劃分至蛋白質(zhì)組學這一學科中來。

然而受制于蛋白質(zhì)組學的鑒定手段門檻較高，很多鑒定技術(shù)人員并未對蛋白質(zhì)組中潛藏著的遺傳學信號給以足夠的關(guān)注與深入研究，也往往忽略了蛋白質(zhì)組技術(shù)僅需一次測量即可獲取大量信息，包括全部的蛋白質(zhì)類型及其數(shù)量，同時，檢測結(jié)果中也可得出蛋白質(zhì)中的每個氨基酸序列[1]。這對于鑒定DNA缺失或DNA濃度低于限制的生物物證鑒定，具有十分特殊的重要意義。

一、蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)簡介

（一）2-DE技術(shù)

2-DE方法，即雙向凝膠電泳方法。2-DE是等電聚束電泳與SDS-PAGE的結(jié)合技術(shù)，換言之就是指攜帶有相同等電點的蛋白質(zhì)，不管其分子數(shù)量多少，在等電場方法的影響下最終都會在某一特殊部位聚合，然后借助SDS-PAGE方法把各種分子數(shù)量的蛋白質(zhì)分開，在電泳后再通過蛋白質(zhì)的上樣量對膠開始添加染料，經(jīng)染料上色后所得的電泳圖是一個二維分布式的蛋白質(zhì)圖像，通過存儲凝膠圖像可以獲得蛋白質(zhì)定性與定量信號，使用圖像解析軟件可以分析蛋白質(zhì)傳遞的各種基因信號。由于傳統(tǒng)的2-DE技術(shù)普遍存在膠和膠之間的重復性不佳的弊端，在此技術(shù)發(fā)展上，2D-DIGE，即雙向差異凝膠電泳法的問世十分有效地克服了這一不足。因為2D-DIGE能夠從同一張雙向電泳膠中分離出來數(shù)種熒光標記的樣本，且首次在2D-DIGE中引進了內(nèi)標的概念，使其在蛋白質(zhì)定量上的結(jié)果更為精準。

（二）MS技術(shù)

MS技術(shù)，即質(zhì)譜技術(shù)。MS技術(shù)以其高度特異性、高靈敏度、高智能化的多項優(yōu)點，被廣泛應用于蛋白質(zhì)識別中。因為長鏈大化合物是不能直接被質(zhì)譜篩選出的，因此必須利用蛋白酶對蛋白質(zhì)進行分割，將其分割成較小的肽段，所用的蛋白質(zhì)酶多為胰酶（Trypsin），Trypsin的特點在于，其能夠在賴氨酸和精氨酸殘基后，完成肽鍵的切斷。而蛋白質(zhì)譜技術(shù)，其基本原理即借助蛋白酶消化蛋白質(zhì)后得到的肽片段混合物，通常情況下，由蛋白質(zhì)酶斷開的蛋白質(zhì)片段上的氨基酸個數(shù)在14個左右，完成全部的酶切流程大概需要耗費10個小時。最新的一項將胰酶固定于液象學色譜分析法上的技術(shù)，則能夠更快地完成全部的酶切流程。上述步驟完成之后，然后在質(zhì)譜儀上產(chǎn)生充能電離，再經(jīng)由質(zhì)譜分析儀和探測器的分析與檢測之后，將特定的質(zhì)量質(zhì)荷之比（m/z）進行分散和收集，然后再利用質(zhì)量分析儀分析得到每個肽片段的m/z，最終能夠制成蛋白質(zhì)的一級質(zhì)譜峰圖。

目前，運用得最多的蛋白質(zhì)組離子化方法為ESI技術(shù)，即電噴霧離子化，是利用電噴霧電離的離子源使肽段離子化，在第一級質(zhì)譜掃描色譜柱分離出來的全部成分，在第二級串聯(lián)質(zhì)譜中選取幾個豐度較高的峰，加以依次分開，并標記它們的第二級斷裂質(zhì)譜。全部步驟不超過一秒鐘，在全部色譜分離步驟中重復數(shù)千次，最終可以得到幾千至數(shù)萬條洗脫肽二級串聯(lián)質(zhì)譜。如果在電離過程中存在強度很大的多肽段，則離子選擇器會對它做二次質(zhì)譜分析。而蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果可以利用前后兩次質(zhì)譜峰圖之間的比對而確定。目前，專業(yè)領(lǐng)域內(nèi)使用的質(zhì)譜儀靈敏度也在不斷地提升，這對于提升蛋白質(zhì)譜技術(shù)的檢測靈敏度也大有裨益。

二、蛋白質(zhì)的定性與定量方法

（一）定性技術(shù)

蛋白質(zhì)的定性往往強調(diào)要達到全面覆蓋的效果，盡管就目前的科學水平來說，八成左右的人體蛋白質(zhì)檢出是能夠?qū)崿F(xiàn)的，然而剩余部分的蛋白質(zhì)，由于或是豐度不足或是疏水性過強等原因，導致其難以檢出。目前，定性技術(shù)運用較多的為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（proteinchip），這是一類全新的生物芯片技術(shù)，其基本原理是將已知的分子產(chǎn)物做上熒光記號，并將其固定在通過特定化學加工后的高固相含量載體上。待測蛋白中，存在能夠與已知的蛋白質(zhì)分子物質(zhì)的特異性融合的種類，這類待測蛋白能夠被準確捕捉到。將捕捉到的待測蛋白進行漂洗后提純，然后再經(jīng)過檢測芯片上各點的熒光強度，再由電子計算機解析結(jié)果，從而實現(xiàn)了檢測各種蛋白質(zhì)的目標。蛋白質(zhì)芯片擁有能夠從ng數(shù)量級的極小樣本中捕捉到豐度很低的低蛋白質(zhì)，并且能夠直接對血清、體液等生物物證進行迅速的高通量檢測。

（二）定量技術(shù)

ITRAQ技術(shù)，即同位素標記技術(shù)。ITRAQ技術(shù)，即同位素標識相對比和絕對定性技術(shù)。主要是同時對4～8種不同種類的蛋白質(zhì)樣本中已被裂解的蛋白質(zhì)多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團進行標記與比對，進而形成幾千個可鑒定多肽，進而運用質(zhì)譜分析法對形成的多肽做定量分析，再運用生物信息學，對數(shù)據(jù)加以更高效的處理。但鑒于蛋白質(zhì)組成的極其復雜性，目前仍未有一個微生物中的蛋白質(zhì)覆蓋率能夠達到百分之百。

三、蛋白質(zhì)的識別技術(shù)

（一）PSM技術(shù)

PSM信息技術(shù)，即肽譜匹配技術(shù)，其基本原理是通過對現(xiàn)存于數(shù)據(jù)系統(tǒng)中的全部待測蛋白質(zhì)進行分割，然后計算分割得到的胰蛋白酶肽的質(zhì)量。進而將理論上的碎片信息與實際圖譜中得到的碎片信息加以比對，同時對兩者的相似性得分進行計算，以此為判斷其匹配與否的依據(jù)。顯然，運用該技術(shù)的過程之中，需要借助專業(yè)的數(shù)據(jù)庫軟件，以及評分方程，一方面要確保檢測數(shù)據(jù)的準確水平，另一方面對于數(shù)據(jù)庫的完整性也提出了很高的要求，這也對能否準確識別到目標多肽產(chǎn)生顯著的影響。此外，PSM方法中的評分步驟并非完全可靠，因為對于錯誤的配對結(jié)果是無法規(guī)避的。因此，為了處理這一問題，引入了錯誤發(fā)現(xiàn)率的概念，即指代整個肽譜配對中發(fā)現(xiàn)錯誤的概率。具體而言，就是在數(shù)據(jù)庫中添加并不實際存在于待測樣本中的誘餌序列，一旦出現(xiàn)與誘餌序列發(fā)生配對的，均可視為錯誤的配對，而錯誤發(fā)現(xiàn)率就是根據(jù)與誘餌肽譜配對的數(shù)量得出的。所以，錯誤發(fā)現(xiàn)率只是估算整個肽譜配對中錯誤量的參考值，并無法表明每一個肽譜配對的可信度，這就必須用其他計算方法來度量。

（二）生物信息學技術(shù)

現(xiàn)代生物信息學一般從微生物基因組學和蛋白質(zhì)組學兩個方向表現(xiàn)。在蛋白質(zhì)研究過程中，生物信息學技術(shù)的主要作用除了能夠進行資料庫的查詢與相關(guān)信息技術(shù)資源的整合之外，而且在蛋白質(zhì)組研究應用領(lǐng)域中，如鑒別蛋白質(zhì)、對已有蛋白質(zhì)組織進行研究等方面的作用也是非常重要的。高流量、大面積的實驗資料經(jīng)過生物信息學系統(tǒng)的處理，就可以對圖像研究、蛋白質(zhì)鑒別與比較等帶來更加方便的幫助。

四、基于蛋白質(zhì)組學的法醫(yī)生物物證鑒定

蛋白質(zhì)組相較于DNA而言，其氨基酸序列同樣是由DNA上的堿基序列編碼而來，因此實質(zhì)上看，兩者所攜帶的為同一種遺傳密碼。因此即使在生物體內(nèi)各個蛋白質(zhì)中的DNA一樣，但各種部位、結(jié)構(gòu)或細胞種類的蛋白質(zhì)組是完全不一樣的，其差別體現(xiàn)在蛋白質(zhì)的種類和濃度。利用蛋白質(zhì)組技術(shù)，不但能夠確定蛋白質(zhì)序列信息，而且還能夠獲取蛋白質(zhì)成分的種類和濃度特征。當生物物證缺失DNA時，依靠氨基酸序列的多態(tài)性，就能夠?qū)崿F(xiàn)基因的鑒定。

（一）利用蛋白濃度的降低推斷死亡時間

蛋白質(zhì)作為人類機體的主要組成之一，機體蛋白質(zhì)會在人類死亡后，逐漸被各種蛋白質(zhì)水解酶以及腐敗菌所溶解，形成氨基酸和小分子的含氮化合物，蛋白質(zhì)的濃度也會隨著死亡時間的增加而逐步下降甚至消失。例如，腦脊液中的白蛋白會在致死后3天內(nèi)完成降解，其降解具有線性特征。因而就可以利用能夠與其產(chǎn)生反應的特定染料對其進行染色，然后對染色得到的化合物做吸收光譜后進行定量分析。最終，可以根據(jù)分析結(jié)果，推斷尸體的死亡時間。

（二）利用蛋白質(zhì)的變化差異推斷死因

在死亡原因的認定中，部分死亡案件死因較為明朗，也很易于得出正確的認定意見。但部分案件因為沒有特異性的指標，對于進行具體的死因判斷存在一定的困難。而體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也會在人體死亡后發(fā)生改變，并且呈現(xiàn)一定的特殊規(guī)律。例如，不同的心臟病變，會導致左右心室中蛋白質(zhì)濃度的差異。如心臟左、右心室的中心尖區(qū)和基底區(qū)域中的多種蛋白質(zhì)，在含量上都具有明顯差別。左右心室即使存在相同類型的蛋白質(zhì)，但是其濃度會因為心室區(qū)域的不同而存在差異。存在于左心室的五種蛋白質(zhì)在心尖中具有更高的含量；而存在于右心室中的兩種蛋白質(zhì)在心尖中具有更高的含量。具體的蛋白質(zhì)種類如圖1所示。因為不同的慢性心臟病變對不同心室的產(chǎn)生影響也是不同的，因此可以利用這一規(guī)律對司法案件中不明的突發(fā)心臟病猝死案件的致死原因進行判斷。

圖1 左右心室濃度較高的蛋白質(zhì)類比

（三）利用SAP的多態(tài)性進行族群推斷

盡管血液、唾液等生物物證的STR分型技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但是由于毛干的基本組成物為角質(zhì)化細胞，其細胞核DNA濃度很低，并且分解極其強烈。因此，利用STR分型的精準度表現(xiàn)很差。而蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性要明顯優(yōu)于角質(zhì)化細胞的細胞核DNA濃度。在不同的生物個體中，蛋白質(zhì)氨基酸順序也具有顯著不同，這就是SAP，即單氨基酸多態(tài)性，主要由nsSNP經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。

從毛干蛋白質(zhì)組中得到的nsSNP可以進行族群推斷，對SNP數(shù)據(jù)進行整合后完成數(shù)據(jù)庫的建立，就能夠利用質(zhì)譜測試毛干蛋白質(zhì)組中數(shù)十種含有SAP的特異性多肽類物質(zhì)序列。這也意味著，毛干SAP的個體辨識，能夠很好填補STR個體識別中毛干識別的不足[2]。

（四）運用蛋白質(zhì)組學分析識別DNA的具體來源

DNA鑒定技術(shù)雖然能夠?qū)ι矸菪畔⑦M行識別，卻難以判斷DNA來自哪一類體液和組織。蛋白質(zhì)組學利用不同蛋白質(zhì)的不同配比以及通過機器學習的方式，來實現(xiàn)對體液中斑跡物質(zhì)來源的識別。通過非靶向技術(shù)，能夠?qū)Σ煌w液斑跡物質(zhì)的特異性標記蛋白進行識別，也可以準確鑒定出混合類型的體液中的有效物質(zhì)。然而，相對于血液與精液混合物的檢出率，陰道分泌物和唾液混合物的檢出率稍顯遜色。因此，通過借助豐度水平的機器學習技術(shù)，對其檢出率加以提高。在實際使用中，還可以通過對槍擊案中現(xiàn)場殘留彈頭上的組織遺留物開展蛋白質(zhì)組學分析，目的是使彈頭結(jié)構(gòu)和槍擊受害人的損傷疤痕加以對應。

五、結(jié)論

運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)手段可以對人死后各個時點的蛋白質(zhì)水平進行準確定性，并尋找其變化規(guī)律，進而對死亡時間做出合理推測，同時運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)手段可以找出不明致死因素的特異性標記，進而探測出蛋白質(zhì)水平和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的交互影響。如果能夠有效把控蛋白質(zhì)樣本生產(chǎn)與存儲過程的均一化，則運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)手段破解法醫(yī)物證鑒定中的疑難問題也就變?yōu)榱丝赡堋?/p>