付長龍，謝新宇，邱志偉，黃艷峰，金靈璐，李西海

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122；3 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建福州 350122

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種因生物因素及力學(xué)異常等引起關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與組織形態(tài)紊亂，致使膝關(guān)節(jié)功能退變乃至喪失的關(guān)節(jié)疾病［1］。其顯著的病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、退化，滑膜炎性浸潤以及繼發(fā)性骨贅形成，臨床常表現(xiàn)為患膝關(guān)節(jié)的慢性疼痛、屈伸活動不利等癥狀，病程后期還可出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動受限甚至致殘，嚴(yán)重危害中老年人的健康［2-3］。KOA 歸屬于中醫(yī)“膝痹”范疇，其病位在骨，歷代醫(yī)家認(rèn)為其病機(jī)主要與肝、腎虧虛，筋骨失養(yǎng)等密切相關(guān)，病機(jī)屬性為本虛標(biāo)實(shí)，本痿標(biāo)痹，故對其治則宜行補(bǔ)腎柔肝、除痹消痛之法［4-7］。

課題組前期從《清宮配方集成》中篩選治療KOA 的高頻、核心用藥組方，以中醫(yī)“肝主筋、腎主骨”理論為核心，重新組方成榮筋拈痛方。該方經(jīng)國醫(yī)大師陳可冀院士審定，由牛膝、當(dāng)歸、獨(dú)活、羌活、防風(fēng)、甘草組成，用于臨床治療KOA 具有良好療效［8］。通過計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，榮筋拈痛方治療KOA 的作用機(jī)制可能與核因子NF-E2 相關(guān)因子/抗氧化元件（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信號通路相關(guān)［9］。KOA軟骨受炎性因子影響導(dǎo)致軟骨中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)升高從而激活Nrf2/ARE 通路。其中，Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）是Nrf2/ARE 通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，激活通路后引起下游血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶-1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO-1］表達(dá)變化。研究證實(shí)，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在KOA 病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用［10-11］，其中，lncRNA NEAT1 在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，加劇軟骨變性［12-13］。研 究 表 明，lncRNA NEAT1 可 以 調(diào) 節(jié)Nrf2/ARE 通路［14］。因此，本研究基于前期臨床及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基礎(chǔ)，觀察榮筋拈痛方對KOA 模型大鼠lncRNA NEAT1 及Nrf2/ARE 通路的影響，探討該方延緩膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇SPF 級2 月齡雄性SD 大鼠45 只，體質(zhì)量（300±10）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005］；飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007］，實(shí)行分籠飼養(yǎng)，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

榮筋拈痛方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司，規(guī)格：9.5 g/袋，生產(chǎn)批號：2006001），將其溶于100 mL生理鹽水中，配制成濃度為0.095 g/mL 的榮筋拈痛方溶液。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅（北京索萊寶科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、RIPA 裂解液（radio immuno precipitation assay）、蛋白上樣緩沖液、10×電泳液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；10×Tris-HCl 緩沖鹽溶液-吐溫（10×Tris buffered saline-tween，10×TBST，北京索萊寶科技有限公司）；Nrf2抗體、HO-1抗體、Keap1抗體、iNOS抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、NQO-1 抗體（博士德生物工程有限公司），GAPDH（美國Signalway Antibody有限公司）；HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；LncRNA NEAT1（Forward：TGGCTAGCTCAGGGCTTCAG，Reverse：TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC）、GAPDH（Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，Reverse：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）引物（福州尚亞生物技術(shù)有限公司）；微量紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司，NanoDrope 2000）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX96）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及動物造模 45 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和碘乙酸鈉組，每組分別15 只、30 只。采用2 %戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注射20 mg/mL 碘乙酸鈉0.05 mL，空白組注射等量生理鹽水。術(shù)后1 周可見大鼠活動頻率下降，驅(qū)趕運(yùn)動時出現(xiàn)跛行，大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹，表明成功復(fù)制KOA 模型［15］。造模后的碘乙酸鈉組采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和榮筋拈痛方組，每組15 只。按臨床等效劑量換算［16］，榮筋拈痛方組的灌胃劑量為1.9 g/（kg·d），即0.095 g/mL 的榮筋拈痛方溶液10 mL/d，分早晚2 次灌胃，連續(xù)灌胃8周，灌胃劑量依據(jù)大鼠體質(zhì)量每周計(jì)算調(diào)整；空白組和模型組給予等量生理鹽水灌服。

1.4.2 組織取材與處理 末次灌胃結(jié)束后，采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，剪開表皮直至暴露出以右膝關(guān)節(jié)為中心約3 cm×3 cm 的區(qū)域。去除骨組織表面附著的肌肉及各種結(jié)締組織，切開韌帶小心打開關(guān)節(jié)腔，注意刀口避免劃傷軟骨組織表面。每組隨機(jī)選擇3只切取右側(cè)股骨置于多聚甲醛中固定以備后續(xù)HE 染色。收集其余大鼠右膝關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，置于液氮中轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，以備后續(xù)進(jìn)行基因及蛋白檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 軟骨組織病理改變 采用HE 染色法觀察各組大鼠右膝軟骨組織病理改變情況。常規(guī)制備大鼠股骨內(nèi)側(cè)髁組織石蠟標(biāo)本，組織切片后進(jìn)行常規(guī)脫蠟復(fù)水，蘇木精浸染10 min，流水輕柔漂洗1 min，快速返藍(lán)（1%鹽酸乙醇溶液）2 s，再經(jīng)0.5%伊紅染液浸染5 s，封固（中性樹脂）后進(jìn)行鏡下觀察并拍照。

1.5.2 軟骨組織Nrf2/ARE 通路蛋白表達(dá)情況 采用Western blot 法檢測各組大鼠軟骨組織中Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap1、iNOS 蛋白含量。提取各組軟骨組織總蛋白，BCA 蛋白定量，配制12%分離膠和5%濃縮膠，上樣后進(jìn)行電泳，采用半干式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉2 h 后洗膜，再將各條膜放入預(yù)先配置好的Nrf2、HO-1、NQO-1、Keap1、iNOS 的一抗中置于4°C 冰箱搖床過夜進(jìn)行充分震蕩反應(yīng)，次日取出一抗，洗膜后加入二抗，待二抗反應(yīng)處理后，使用ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯影，于凝膠成像儀下進(jìn)行曝光成像，最后分析儲存。

1.5.3 軟骨組織lncRNA NEAT1 表達(dá)情況 采用實(shí)時PCR 法檢測各組大鼠軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平。將軟骨組織研磨后，采用Trizol 法提取總RNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測各樣本RNA濃度（g/L）和A260/A280 值。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：55 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃。以1 μL cDNA 為模板擴(kuò)增lncRNA NEAT1。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照基因，計(jì)算目的基因2-ΔΔCt，比較分析各組lncRNA NEAT1水平變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用方差分析，若方差齊，兩兩比較采用LSD-t法；若方差不齊，兩兩比較則采用Games-Howell 法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠軟骨組織病理改變情況

HE 染色結(jié)果顯示，空白組大鼠軟骨組織切線層連續(xù)且完整，細(xì)胞質(zhì)及其基質(zhì)成分分布均勻且著色淺紅，移行層中軟骨細(xì)胞縱向條索狀分布且排列規(guī)律，輻射層、鈣化層結(jié)構(gòu)完整且清晰；模型組軟骨組織切線層發(fā)生破壞，纖維方向出現(xiàn)偏移、變薄，軟骨細(xì)胞外露且抱團(tuán)簇集生長，移行層與輻射層的軟骨細(xì)胞呈無序分布排列狀態(tài)，部分軟骨細(xì)胞出現(xiàn)鈣化，鈣化層軟骨細(xì)胞鈣化現(xiàn)象明顯，鈣化層與軟骨下骨間的黏合線起伏較大，且連續(xù)性部分中斷；榮筋拈痛方組的切線層與關(guān)節(jié)面基本平行且完整，移行層、輻射層、鈣化層及其他層次相對清晰可辨。見圖1。

圖1 軟骨組織HE染色圖（×200）Figure 1 HE staining results of cartilage tissue(×200)

2.2 3 組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Nrf2/ARE 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Keap1、iNOS 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，榮筋拈痛方組Keap1、iNOS蛋白表達(dá)明顯更低（P＜0.05），Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表達(dá)明顯更高（P＜0.05）。這提示榮筋拈痛方可上調(diào)Nrf2 信號及抗氧化信號分子表達(dá)，下調(diào)促氧化信號分子表達(dá)。見表1、圖2。

表1 3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Table 1 Comparison of Nrf2/ARE pathway related protein expression in articular cartilage in three groups（±s）

表1 3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）Table 1 Comparison of Nrf2/ARE pathway related protein expression in articular cartilage in three groups（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;compared with the model group,2)P＜0.05.

組別空白組模型組榮筋拈痛方組n333 Keap1/GAPDH 0.560 5±0.059 5 0.932 6±0.063 91）0.659 5±0.089 12）Nrf2/GAPDH 0.292 3±0.043 9 0.103 6±0.021 11）0.198 8±0.036 52）HO-1/GAPDH 0.559 2±0.042 1 0.313 0±0.025 11）0.627 1±0.040 82）NQO-1/GAPDH 0.880 3±0.170 3 0.404 7±0.067 11）0.692 9±0.063 62）iNOS/GAPDH 0.386 1±0.016 1 0.853 5±0.015 81）0.553 4±0.042 72）

圖2 3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白條帶圖Figure 2 Protein strip diagram of Nrf2/ARE pathway indicator in articular cartilage in three groups

2.3 3 組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1 水平比較

Real-time PCR 結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組lncRNA NEAT1 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，榮筋拈痛方組lncRNA NEAT1 水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平比較（±s）Table 2 Expression of lncRNA NEAT1 in articular cartilage in three groups（±s）

表2 3組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1水平比較（±s）Table 2 Expression of lncRNA NEAT1 in articular cartilage in three groups（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group, 1) P＜0.05; compared with the model group,2)P＜0.05.

組別空白組模型組榮筋拈痛方組n333 NEAT1/GAPDH 1 1.799 8±0.085 11）1.451 6±0.109 52）

3 討 論

3.1 KOA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)

本研究結(jié)果顯示，HE 染色可觀察到模型組大鼠軟骨變薄、細(xì)胞無序分布，這提示模型組關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生明顯退行性改變，與GUZMAN 等［17-18］研究一致。此外，本研究結(jié)果顯示，模型組軟骨組織中l(wèi)ncRNA NEAT1 水平升高，Keap1、iNOS 蛋白含量顯著升高，Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白含量顯著降低，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)參與KOA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變。這可能與以下因素有關(guān)：①生理?xiàng)l件下軟骨中低水平ROS 有助于維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及功能，而KOA 軟骨受到炎性因子誘導(dǎo)后iNOS 表達(dá)高度上調(diào)并產(chǎn)生大量的ROS。過量ROS 會激活核因子κB 途徑增加炎癥，同時抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成并誘導(dǎo)基質(zhì)降解蛋白酶表達(dá)，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致軟骨降解［19-21］。②過度產(chǎn)生ROS會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激，激活以Nrf2/ARE通路為代表的抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)。Keap1具有氧化還原感受器功能，非氧化應(yīng)激時與Nrf2 結(jié)合，氧化應(yīng)激時則與Nrf2 解離引起下游HO-1、NQO-1 表達(dá)升高以及時清除過量的ROS，產(chǎn)生抗氧化效果［22-23］。而KOA 軟骨中Nrf2 表達(dá)失調(diào)，同時HO-1、NQO-1 表達(dá)受炎癥因子抑制，不能有效清除細(xì)胞中的過量ROS，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨降解［24］。③Nrf2/ARE 通路的表達(dá)也同時受非編碼RNA 的調(diào)控［25］。其中l(wèi)ncRNA NEAT1 在OA 軟骨中高表達(dá)，且與調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路相關(guān)［26-27］。lncRNA NEAT1 調(diào)節(jié)的Nrf2/ARE 信號通路是延緩KOA 軟骨退變的潛在途徑。

3.2 榮筋拈痛方延緩KOA 大鼠軟骨退變可能與Nrf2/ARE通路抗ROS作用有關(guān)

本研究結(jié)果表明，與模型組比較，榮筋拈痛方組大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變程度明顯減輕，lncRNA NEAT1表達(dá)水平下調(diào)，Keap1、iNOS 蛋白含量明顯降低，Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白含量明顯升高，這提示榮筋拈痛方延緩KOA 大鼠軟骨退變可能與Nrf2/ARE 通路抗ROS作用有關(guān)。這可能與以下因素有關(guān)：①榮筋拈痛方干預(yù)后，軟骨組織中iNOS 表達(dá)顯著降低，細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生減少，從而緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩OA 軟骨退變。②HO-1、NQO-1 是Nrf2 的下游靶蛋白，其表達(dá)上調(diào)有助于抵抗細(xì)胞氧化應(yīng)激帶來的損傷［28-31］，榮筋拈痛方作用于Nrf2/ARE 通路，下調(diào)Keap1表達(dá)，上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)下游HO-1及NQO-1，通過清除過量ROS、緩解軟骨組織氧化應(yīng)激達(dá)到延緩OA軟骨退變的療效。③榮筋拈痛方干預(yù)下調(diào)軟骨組織lncRNA NEAT1 表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Nrf2/ARE 通路，促使Keap1 蛋白表達(dá)降低，Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表達(dá)升高，增強(qiáng)Nrf2/ARE 通路抗ROS 作用以緩解軟骨氧化應(yīng)激，延緩OA 軟骨退變。

4 小 結(jié)

榮筋拈痛方在延緩KOA 大鼠軟骨退變方面具有一定療效，其機(jī)制可能與其下調(diào)lncRNA NEAT1水平，上調(diào)Nrf2 信號及抗氧化信號分子表達(dá)，下調(diào)促氧化信號分子表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激水平有關(guān)。本研究仍存在一些不足，如lncRNA NEAT1 調(diào)節(jié)Nrf2/ARE 通路的作用機(jī)制尚不明確，還需在后續(xù)研究中進(jìn)一步驗(yàn)證明確。