周紫艷， 孫苗苗， 唐曄翎， 梁鵬晨， 梁冬雨， 常慶,

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海 200120； 2. 上海大學(xué)微電子學(xué)院，上海 201800； 3. 上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院臨床科研中心，上海 201800)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、骨強度下降、骨折風(fēng)險增大為特征的全身性代謝性骨病[1-2]。在中醫(yī)藥領(lǐng)域中，大多以“骨痹”“骨痿”“骨枯”等命名，“骨痿”的發(fā)生常由于經(jīng)絡(luò)不通、氣血瘀阻所致[3]。丹參是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參對去卵巢性骨質(zhì)疏松、糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松、肝纖維化性骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎致骨質(zhì)疏松、維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松等均有一定的治療作用[5]，同時也有研究表明丹參的水溶性成分對骨代謝具有一定的多靶點調(diào)節(jié)作用[6]。

虛擬篩選又稱計算機篩選，即在進行生物篩選之前，利用計算機進行分子對接，分子對接通常是在小分子(配體)與蛋白大分子(靶點)之間進行的，已成為了解活性化合物和分子靶點之間相互作用的一項重要工具[7]。通過分子對接能夠預(yù)測靶點蛋白與活性化合物之間的結(jié)合能，從而找出治療某些疾病的潛在藥物[8]。本研究采用分子對接與活性驗證相結(jié)合的方法篩選丹參中促進成骨的有效活性成分, 以期為深入挖掘丹參抗骨質(zhì)疏松癥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)新藥提供策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 MC3T3-E1前成骨細胞系購于中科院上海細胞庫。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺、生物安全柜(蘇州凈化設(shè)備公司)，倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)，電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)，CO2細胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)，臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，電熱恒溫水槽(常州金壇良友儀器有限公司)，渦旋混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.3 主要試劑及材料 胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、α-MEM、PBS(美國Gibco公司)，胰酶(賽默飛世爾科技公司)，二甲基亞砜、茜素紅(美國Sigma公司)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，DAPI(上海威奧生物科技有限公司)，鬼筆環(huán)肽(北京索萊寶科技有限公司)，CCK-8(東仁化學(xué)科技有限公司)，丹參素、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA(成都瑞思芬公司)，鹽酸多巴胺、氫氧化鈉(羅恩試劑)，醫(yī)用純鈦片(上海正豐鈦金屬有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 丹參中活性成分的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP數(shù)據(jù)庫，https://tcmspw.com/tcmsp.php)中，根據(jù)吸收、分布、代謝、排泄等參數(shù)，確定以O(shè)B值≥30%，DL值≥0.18為條件進行篩選。

1.2.2 分子對接 通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性成分的mol2格式的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過文獻搜集找到17種不同成骨相關(guān)的蛋白靶點，并從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中下載17種蛋白靶點的pdb格式的文件。通過Autodock tools軟件將活性成分的mol2格式與17種蛋白靶點的pdb格式轉(zhuǎn)化成pdbqt格式，并確定每個蛋白靶點的活性口袋，再使用Autodock vina對活性成分和17種蛋白靶點分別進行對接。根據(jù)對接得分和文獻的支持，最終選擇丹參的4個活性成分進行后續(xù)實驗。

1.2.3 試劑的制備 篩選出來的丹參活性成分是水溶性成分丹參素、丹酚酸B以及脂溶性成分丹參酮ⅡA、隱丹參酮。丹參素和丹酚酸B溶解在含10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，分別將其配置成濃度為0、20、40、60、80、100、120、140 μg/mL的溶液。丹參酮ⅡA和隱丹參酮使用DMSO進行溶解，隨后使用含10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液將其配置成0、1、5、10、20、40 μmol/L的溶液，待用。

1.2.4 細胞培養(yǎng) 將MC3T3-E1小鼠前成骨細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。每2 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細胞在培養(yǎng)皿中生長密度達到80%～90%時，對細胞進行傳代以保持細胞活力。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力 將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞使用胰酶消化，離心，并用培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)至5×104個/孔，接種到96孔板中，每孔接種100 μL細胞懸浮液。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，將培養(yǎng)液換成“1.2.3”方法制備的溶液，37 ℃、5% CO2繼續(xù)孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2孵育1 h，使用酶標(biāo)儀在波長450 nm下測每孔光密度(D)值。

1.2.6 細胞ALP活性測定 將MC3T3-E1細胞以2×104個/孔的密度接種到24孔板中，每孔500 μL。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液換成對應(yīng)制備好的溶液，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2條件下孵育，每2 d更換1次培養(yǎng)液。分別在1、3、5、7 d從每孔吸取30 μL溶液于96孔板中，依次加入50 μL緩沖液、50 μL基質(zhì)液，37 ℃水浴下孵育15 min，加入150 μL顯色劑，使用酶標(biāo)儀在波長520 nm下測每孔D值。ALP活力(%)=(D測定-D空白)/(D標(biāo)準(zhǔn)-D空白)×100%。

1.2.7 DAPI-鬼筆環(huán)肽染色觀察促成骨作用 MC3T3-E1細胞按1×106個/孔的密度接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h ，將培養(yǎng)液換成濃度為0、80、140 μg/mL的丹酚酸B溶液，在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后使用4%多聚甲醛溶液浸泡40 min，PBS洗滌。加入FITC-鬼筆環(huán)肽溶液染色細胞質(zhì)45 min，PBS洗滌。加入DAPI溶液染色細胞核15 min，PBS洗凈，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.8 茜素紅染色觀察促成骨作用 將MC3T3-E1細胞誘導(dǎo)分化后，分別以0(對照)、80和140 μg/mL丹酚酸B在6孔板中處理20 d后，除去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次。加入適量茜素紅S染色液，均勻覆蓋細胞，室溫染色30 min。用PBS沖洗細胞3次，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 丹參中活性成分的篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出43個丹參的有效活性成分。此外，雖然丹參素和丹酚酸B等成分的OB和DL值沒有符合上述篩選條件，但在臨床上已有大量使用，且文獻調(diào)研也發(fā)現(xiàn)其是丹參的有效活性成分，因此將這兩種成分也納入研究目標(biāo)中。表1為43種丹參的有效活性成分。

表1 丹參的有效活性成分

續(xù)表

2.2 分子對接

使用Autodock vina完成43種藥物分子與17種蛋白的分子對接。首先將蛋白與它們的原配體進行對接，對接得分(結(jié)合自由能)如表2所示。再將蛋白分別與藥物分子對接得到對應(yīng)的對接得分，表3為相對對接得分最低的10個成分的得分情況(相對對接得分=蛋白與藥物分子對接得分-蛋白與原配體對接得分)，分?jǐn)?shù)越低，有效活性成分和蛋白靶點之間的作用力越大。其中，與17種蛋白靶點對接效果最好的是丹參素，對接得分是-55.9 kcal/mol，因此將丹參素納入后續(xù)的實驗中。在這10個效果最好的活性成分中，丹酚酸B的對接得分為-25.9 kcal/mol，丹酚酸B也是常見的丹參中的活性成分，并且通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可以促進成骨，因此將丹酚酸B也納入后續(xù)實驗中。另外，根據(jù)查閱大量丹參的相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA和隱丹參酮都是丹參中非常常見及常用的有效成分，它們的對接得分雖然比較高，但丹參酮ⅡA是丹參中最主要的成分，而據(jù)報道隱丹參酮對骨質(zhì)疏松癥有一定的效果，因此我們將丹參酮ⅡA和隱丹參酮也納入后續(xù)的實驗中。

表3 43種活性成分與17種蛋白靶點的相對對接得分最低的10個成分得分情況 kcal/mol

圖1為根據(jù)相對對接得分使用R語言繪制的熱圖，由此可以更直接地看出整體的對接得分情況。熱圖中方塊的顏色越紅，代表對應(yīng)的分子與蛋白的對接自由能分?jǐn)?shù)的總和越低，對接越穩(wěn)定，該化合物越有可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物。

熱圖中各橫坐標(biāo)均為17個蛋白靶點，縱坐標(biāo)為各活性成分分子

圖2為丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、隱丹參酮的對接結(jié)果示意圖，通過該結(jié)果可以看到丹參素與其殘基GLN-37、ASP-169通過氫鍵作用相結(jié)合，丹酚酸B與其殘基GLN-37、GLU-73、ASP-151、HIS-149、ILE-148等通過氫鍵作用相結(jié)合，丹參酮ⅡA及隱丹參酮均與其殘基GLU-380通過氫鍵作用相結(jié)合。

圖2 丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、隱丹參酮的對接結(jié)果示意圖

2.3 丹參活性成分對MC3T3-E1細胞的作用

丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA及隱丹參酮的不同濃度溶液對MC3T3-E1細胞的增殖效果如圖3所示。丹酚酸B能促進MC3T3-E1細胞的增殖，而丹參素、丹參酮ⅡA和隱丹參酮對MC3T3-E1細胞沒有增殖作用。

#：P<0.01,與0 μg/mL丹酚酸B比較

ALP活性測定結(jié)果表明，丹參素和丹酚酸B能顯著增加MC3T3-E1細胞的ALP活性，而丹參酮ⅡA和隱丹參酮則沒有明顯效果。見圖4。

#：P<0.01,與對應(yīng)的0 μg/mL丹參素、丹酚酸B或0 μmol/L隱丹參酮比較

2.4 DAPI-鬼筆環(huán)肽雙染色實驗結(jié)果

細胞增殖情況及ALP活性測定結(jié)果顯示，80 μg/mL的丹酚酸B對MC3T3-E1小鼠前成骨細胞增殖的效果最好。進一步應(yīng)用0、80、140 μg/mL 3組濃度丹酚酸B處理MC3T3-E1細胞，48 h后用鬼筆環(huán)肽和DAPI對處理后的細胞進行雙染，熒光顯微鏡下細胞形態(tài)，見圖5。與CCK-8及ALP活性測定實驗結(jié)果相似，丹酚酸B能夠促進MC3T3-E1細胞增殖，且80 μg/mL濃度條件下效果最為顯著。

圖5 熒光顯微鏡下MC3T3-E1細胞DAPI-鬼筆環(huán)肽雙染情況(100×)

2.5 MC3T3-E1細胞茜素紅染色結(jié)果

茜素紅與鈣離子以螯合方式形成復(fù)合物，產(chǎn)生橘紅色沉積(即鈣結(jié)節(jié))。茜素紅染色結(jié)果顯示，培養(yǎng)21 d后各組均可見不同程度的鈣結(jié)節(jié)形成。與0 μg/mL組相比，80 μg/mL丹酚酸B對MC3T3-E1細胞形成鈣化面積明顯增多、顏色加深，而140 μg/mL丹酚酸B對MC3T3-E1細胞形成鈣結(jié)節(jié)的影響次之。見圖6。

A：茜素紅染色整體情況；B：熒光顯微鏡下茜素紅染色情況(100×)

3 討論

目前，大部分治療骨質(zhì)疏松癥的藥物都是西藥，這些藥物通常會產(chǎn)生不良反應(yīng)，從而導(dǎo)致依從性降低[9]?，F(xiàn)代臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，中醫(yī)中藥在治療骨質(zhì)疏松癥中療效頗為顯著且安全性高[10-11]。本研究通過數(shù)據(jù)庫搜索和文獻調(diào)研，挑選43種候選活性成分和17個骨質(zhì)疏松癥相關(guān)蛋白，包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶1/2/3、P38蛋白激酶α/β/δ、轉(zhuǎn)化生長因子激酶1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1/2、糖原合成酶激酶3β、雌激素受體α/β、黃體酮受體、酪氨酸激酶2β和組織蛋白酶K。使用Autodock vina進行分子對接，根據(jù)對接所得到的結(jié)合自由能以及蛋白與原配體之間的結(jié)合自由能之間的相對結(jié)合自由能的總和，發(fā)現(xiàn)與骨質(zhì)疏松癥的17個靶點蛋白對接效果最好的10個丹參活性成分。其中，對接得分最低的是丹參素。丹參素作為丹參中的一個水溶性化合物，由乳酸和兒茶酚組成，是一種含有兩個酚羥基的化合物。有報道稱丹參素可通過Wnt/Oxo3a信號通路降低氧化應(yīng)激對成骨細胞分化的有害影響[12]。丹酚酸B是較為常見的丹參活性成分，由3分子丹參素和1分子咖啡酸縮合而成，在這10個活性成分中丹酚酸B的對接效果也較好。Ji等[13]發(fā)現(xiàn)載丹酚酸B的殼聚糖/羥基磷灰石支架可以通過血管生成和成骨促進節(jié)段性骨缺損的修復(fù)。Cui等[14]報道丹酚酸B可以通過刺激成骨和骨髓血管生成以防止強的松致大鼠骨丟失。Xu等[15]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B通過激活ERK信號通路促進人間充質(zhì)干細胞成骨。

除了丹參素和丹酚酸B，本研究將丹參酮ⅡA和隱丹參酮也納入實驗。丹參酮ⅡA和隱丹參酮是丹參的脂溶性活性成分。Zhu等[16]研究表明，丹參酮ⅡA通過NF-κB信號通路保護骨質(zhì)疏松小鼠成骨細胞抗氧化應(yīng)激。隱丹參酮具有抗炎，保護神經(jīng)、心血管、內(nèi)臟以及抗代謝紊亂等作用，可調(diào)節(jié)ERK和NF-κB信號通路，抑制NF-κB受體活化因子配體誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生，改善骨質(zhì)疏松癥[17]。

因此，本研究選取丹參素、丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮作為細胞驗證成分，探究其對MC3T3-E1小鼠前成骨細胞系的作用。結(jié)果表明丹酚酸B在20～120 μg/mL濃度范圍具有顯著促進細胞增殖的作用，而其他3種化合物的增殖作用不明顯；丹參素和丹酚酸B均可顯著增加細胞ALP活性。故選定丹酚酸B作為對細胞成骨形態(tài)和礦化結(jié)節(jié)研究的對象，DAPI-鬼筆環(huán)肽雙染實驗和茜素紅染色結(jié)果證實丹酚酸B在80 μg/mL濃度時對MC3T3-E1細胞的促成骨作用效果最好。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)通過虛擬篩選技術(shù)篩選出的丹酚酸B在體外具有較好的促成骨細胞增殖和礦化作用。后續(xù)將在動物實驗中進行驗證，以進一步證明丹酚酸B具有良好的體內(nèi)促成骨作用。