徐娟，彭輝勇，蔡燕

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 1. 重癥醫(yī)學(xué)科， 2. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)科常見疾病，該病是由于宿主對(duì)于感染抵抗失調(diào)所引起的威脅生命的多器官功能異常[1-2]。免疫功能紊亂和凝血功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)在膿毒癥免疫功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[4]。有研究證實(shí)，Th1/Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子失衡與膿毒癥疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為Th1細(xì)胞減少，Th2細(xì)胞增多，Th1/Th2比值下降[5]，但具體機(jī)制尚不完全清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于 200個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，幾乎不編碼蛋白，具有細(xì)胞和組織特異性[6]。TMEVPG1是一種位于干擾素(interferon，IFN)-γ基因下游約45 kb的非編碼RNA。Collier等[7]研究發(fā)現(xiàn)TMEVPG1調(diào)控Th1 細(xì)胞分泌的IFN-γ。這一結(jié)果提示，TMEVPG1可能與膿毒癥中Th1細(xì)胞失衡有關(guān)。因此，本研究旨在通過檢測(cè)膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中TMEVPG1的變化，并分析其與IFN-γ及臨床參數(shù)的相關(guān)性，探討其潛在診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021年1月至12月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的31例膿毒癥患者。按照28 d預(yù)后分為存活組(n=25)與死亡組(n=6)。膿毒癥組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡≥18 歲；② 符合2016 年膿毒癥/膿毒性休克治療國(guó)際指南膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；③ ICU住院時(shí)間>3 d；④ 能獲得完整臨床資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 妊娠及哺乳期婦女；② 自身免疫病或長(zhǎng)期服用免疫抑制劑、免疫功能低下者；③ 血液系統(tǒng)疾病者；④ 各種疾病終末期患者。另選取同時(shí)期來院體檢健康者32例為對(duì)照組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 性別和年齡與膿毒癥組匹配；② 無急性或慢性感染性疾??；③ 未服用免疫抑制類藥物；④ 無自身免疫病、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病。收集受試者相關(guān)臨床資料，包括性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)，并計(jì)算中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與淋巴細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)比值(N/LPR)，急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ)，C反應(yīng)蛋白，降鈣素原。

本研究方案經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在征得所有受試者的書面知情同意后，在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院采集血液樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究中描述的所有操作都符合生物安全和機(jī)構(gòu)安全程序。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs分離 用EDTA-K2靜脈采血管(美國(guó)BD公司)采集靜脈血2 mL，3 000 r/min，離心10 min后棄去血漿，剩余血細(xì)胞加入1 mL磷酸鹽緩沖液混勻，按照1 ∶1比例加入含F(xiàn)icoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)天津?yàn)笊锕?的離心管中，按照試劑盒使用說明分離人PBMCs，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TMEVPG1和IFN-γmRNA水平 PBMCs中加入500 μL RNA裂解液(Lysis緩沖液)，根據(jù)RNA快速提取試劑盒(中國(guó)奕杉生物公司)要求提取總RNA。提取的RNA使用NanoDrop?ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司)檢測(cè)RNA濃度和純度，以D(260 nm)/D(280 nm)和D(260 nm)/D(230 nm)比值評(píng)估RNA純度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)合成cDNA。采用TB GreenTMPremix EX TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(qRT-PCR)。引物序列，TMEVPG1：上游5′-GCTGATGATGGTGGCAATCT-3′，下游5′-TTAGCAGTTGGTGGG-CTTCT-3′；IFN-γ：上游 5′-GAGTGTGGAGACCATCAAGGA-3′，下游5′-TGTATTGCTTTGCGTTGGAC-3′；β-肌動(dòng)蛋白：上游5′-GTCGTCGCTGCTGCCTT-TCC-3′，下游 5′-CAGTGCGTGCCTTGCCTCA-3′。使用β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床特征

31例膿毒癥患者納入本研究，其中男24例，女7例，年齡37～86歲，平均年齡58歲。32例年齡和性別匹配的健康志愿者為對(duì)照組，其中男22例，女10例，年齡38～71歲，平均年齡55歲。膿毒癥組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、NLR、N/LPR及C反應(yīng)蛋白水平均高于對(duì)照組，而LYM和PLT低于對(duì)照組。膿毒癥組和對(duì)照組主要臨床資料統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 膿毒癥組和對(duì)照組主要臨床資料統(tǒng)計(jì)

2.2 膿毒癥患者外周血中TMEVPG1水平分析

如圖1A所示，膿毒癥組PBMCs中TMEVPG1水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與存活組相比，膿毒癥死亡組中TMEVPG1水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1B)。采用Spearman相關(guān)性分析進(jìn)一步分析TMEVPG1與APACHE Ⅱ評(píng)分的關(guān)系，結(jié)果顯示，膿毒癥患者TMEVPG1與APACHE Ⅱ評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.483，P=0.006)，見圖1C。

A：膿毒癥組和對(duì)照組PBMCs中TMEVPG1水平比較；B：膿毒癥存活組和死亡組的TMEVPG1水平比較；C：膿毒癥患者TMEVPG1水平與APACHE Ⅱ評(píng)分相關(guān)性分析

2.3 膿毒癥患者TMEVPG1與NLR、N/LPR相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1與NLR(r=-0.397，P=0.027)及N/PLR(r=-0.359，P=0.047)均存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。見圖2。

圖2 膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1水平與NLR、N/LPR相關(guān)性分析

2.4 膿毒癥患者外周血中IFN-γ mRNA水平的變化

膿毒癥患者PBMCs中IFN-γmRNA水平明顯低于健康對(duì)照者(圖3A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。相關(guān)性分析顯示，膿毒癥患者中TMEVPG1與IFN-γmRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.436，P=0.014)，見圖3B。

A：兩組PBMCs中IFN-γ mRNA水平比較；B：膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1與IFN-γ mRNA相關(guān)性分析

2.5 TMEVPG1對(duì)膿毒癥的診斷價(jià)值評(píng)估

ROC曲線分析TMEVPG1作為膿毒癥診斷標(biāo)志物的價(jià)值，結(jié)果顯示，TMEVPG1可以將膿毒癥組和對(duì)照組區(qū)分開，其曲線下面積為0.84，95%CI為0.75～0.94；最佳截?cái)嘀禐?.52時(shí)，敏感度為70.97%，特異度為81.25%(圖4)。結(jié)果表明，TMEVPG1具有作為膿毒癥診斷分子標(biāo)志物的潛能。

圖4 TMEVPG1的ROC曲線分析

3 討論

據(jù)GENCODE的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，人類基因組包含超過16 000個(gè)lncRNAs基因，然而大多數(shù)lncRNAs功能未被鑒定，使之成為轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物[8]。目前，越來越多的研究表明lncRNAs具有重要的分子作用和細(xì)胞功能[9-10]。根據(jù)其定位不同，lncRNAs主要分為增強(qiáng)和抑制蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄或翻譯兩大類功能[11]。其中，定位于細(xì)胞核的lncRNAs主要以順式或反式作用形式調(diào)控基因表達(dá)[12]；定位于細(xì)胞質(zhì)的lncRNAs主要發(fā)揮內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的作用，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合microRNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，TMEVPG1是一種Th1特異性的lncRNA，可與T-bet一起提高鼠Th1細(xì)胞中IFN-γ的水平[7]。Wang等[14]同樣發(fā)現(xiàn)TMEVPG1能夠促進(jìn)人Th1細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)。然而，TMEVPG1在膿毒癥患者中的作用尚不清楚。本研究證實(shí)，膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1表達(dá)降低，且與同樣低表達(dá)的IFN-γ呈顯著正相關(guān)。IFN-γ基因編碼一種可溶性細(xì)胞因子IFN-γ，屬于Ⅱ型干擾素，可由Th1細(xì)胞等分泌[7]。IFN-γ與干擾素受體結(jié)合，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫，尤其是抗胞內(nèi)病原體感染[4]。因此，推測(cè)膿毒癥中Th1細(xì)胞及IFN-γ水平降低可能與TMEVPG1表達(dá)降低有關(guān)。

Th1細(xì)胞是一類分泌IFN-γ、IL-2、TNF等細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞亞群，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]。研究表明，Th1/Th2失衡通過破壞機(jī)體炎癥因子平衡導(dǎo)致膿毒癥病情加重[15]。王建峰等[16]證實(shí)，膿毒癥患者體內(nèi)存在Th1向Th2漂移，導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)。楊衛(wèi)星等[5]發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者Th1/Th2比值下降，且與病情嚴(yán)重程度有關(guān)，而治療后Th1向Th2轉(zhuǎn)化得以糾正。APACHE Ⅱ評(píng)分是評(píng)估膿毒癥病情嚴(yán)重程度的常用指標(biāo)，并與患者預(yù)后密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1水平與APACHE Ⅱ評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)。這表明，膿毒癥患者TMEVPG1表達(dá)越低，APACHE Ⅱ評(píng)分越高，患者病情越嚴(yán)重。本研究同時(shí)比較了膿毒癥死亡組和存活組TMEVPG1的差異，結(jié)果顯示死亡組中TMEVPG1水平略低于存活組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因，一方面TMEVPG1僅能反映膿毒癥患者體內(nèi)Th1細(xì)胞情況，不能反映其他炎癥細(xì)胞(如Th17、Treg)的變化；另一方面可能由于納入的樣本量太少，這需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入機(jī)制研究。

中性粒細(xì)胞是早期免疫應(yīng)答細(xì)胞，參與膿毒癥患者體內(nèi)病原微生物清除和免疫防御作用[18]。淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的重要組成部分[19]，NLR反映外周血中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的平衡狀態(tài)。研究顯示，NLR與膿毒癥患者體內(nèi)免疫功能活化情況及患者預(yù)后密切相關(guān)[20-21]。膿毒癥患者常合并凝血功能異常，而NLR不能反映機(jī)體凝血功能變化，通過加入血小板參數(shù)，N/LPR很好地反映機(jī)體凝血功能和免疫狀態(tài)[22]。劉大東等[23]證實(shí)，N/LPR對(duì)膿毒癥28 d病死率預(yù)測(cè)價(jià)值優(yōu)于NLR。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1水平與NLR和N/PLR均存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這提示，TMEVPG1與膿毒癥患者病情及免疫狀態(tài)密切相關(guān)。王子宏等[24]研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞/白蛋白比值具有預(yù)測(cè)膿毒癥患兒死亡風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值，本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，TMEVPG1具有作為膿毒癥生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值，能夠一定程度上反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。

綜上所述，膿毒癥患者PBMCs中TMEVPG1顯著降低，并可能通過調(diào)節(jié)IFN-γ參與膿毒癥的疾病過程。TMEVPG1是膿毒癥潛在的生物標(biāo)志物，但是還需要更大膿毒癥群體研究來進(jìn)行驗(yàn)證。