邢冰琪，李 玥，李 娟*

（1.山東省立第三醫(yī)院藥學(xué)部，濟(jì)南 250031；2.泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000）

中藥配伍理論是中醫(yī)藥理論的精華之一，開(kāi)展方劑配伍規(guī)律的現(xiàn)代研究對(duì)于繼承和發(fā)展中藥配伍理論具有重要理論意義,同時(shí)也為更有效地指導(dǎo)臨床和中藥新產(chǎn)品研制提供依據(jù)[1-4]。心律失常是臨床上主要心血管疾病之一，研究表明黃連、苦參均對(duì)心血管疾病療效顯著，黃連解毒湯及其配伍成分在臨床上已用于高血壓病、心絞痛的治療，苦參堿可以從多個(gè)方面作用于心血管系統(tǒng)，具有抗心律失常、抗慢性心功能不全、保護(hù)心肌缺血、抗心肌細(xì)胞纖維化等作用。本文旨在探討不同配伍苦參與黃連聯(lián)用的生物堿成分的變化及抗心律失常的作用，為臨床應(yīng)用苦參和黃連提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察不同比例黃連-苦參水煎液“共有峰”的影響，為研究黃連與苦參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分變化提供可行手段。本文旨在建立黃連、苦參的HPLC 指紋圖譜測(cè)定方法。利用指紋圖譜分析軟件，分析黃連、苦參水煎液7 個(gè)不同比例配伍后樣品間的內(nèi)在差異。為臨床辨證用藥，方劑審因增減提供依據(jù)，也為制定復(fù)方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀、AE200 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司），KDM可調(diào)控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱有限公司），SK5200H超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），AB135-S 電子分析天平，HH 恒溫水浴鍋，876-1 型真空干燥箱（南通科學(xué)儀器廠），SENCOR-205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110713-100911）、苦參堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110805-201117）、氧化苦參堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110780-201007）、藥根堿對(duì)照品（上海源葉科技有限公司，批號(hào)：20111109）、槐定堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110784-200303）、鹽酸巴馬汀對(duì)照品（北京恒元啟天化工技術(shù)研究院、北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制，批號(hào)：MUST-11122703）、甲醇（TEDLA，MS1922-001,LOT:13065034）、乙腈（TEDLA,AS1122-001,LOT:13075017）、磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：2012120）、超純水（液相用）、去離子水（提取用）、其它試劑為分析純，黃連（批號(hào)：130308）、苦參（批號(hào)：130321）藥材購(gòu)自于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，；經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院教授張學(xué)順鑒定，黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch 干燥根莖?？鄥槎箍浦参锟鄥ophora flavescensAit.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成0.603 mg/mL 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取苦參堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.553 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取氧化苦參堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.550 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 將不同比例配伍的樣品分別置于圓底燒瓶中，加12 倍量水回流提取，提取3 次，每次提取2 h，合并3 次提取液，濾過(guò)，濾液濃縮并定容至50 mL，作為濃儲(chǔ)液，取1 mL 加水定容至10 mL容量瓶，作為供試品溶液。

2.2 高效液相色譜法色譜條件的篩選

2.2.1 流動(dòng)相的確定 為了考察并優(yōu)化高效液相色譜條件，本實(shí)驗(yàn)選取了4 組流動(dòng)相系統(tǒng)：乙腈:純水、乙腈:0.1%磷酸水溶液、甲醇:純水、甲醇:0.1%磷酸水溶液，各流動(dòng)相系統(tǒng)的色譜圖如下，由色譜圖結(jié)果可知：以乙腈:0.1%磷酸水溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，色譜圖的主要色譜峰保留時(shí)間適中，分離度良好，因此選擇乙腈:0.1%磷酸水溶液的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫[5-7]，見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取同一配伍（黃連：苦參1:1）供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)定供試品溶液在210 nm、220 nm、265 nm、345 nm 下的色譜圖，每次進(jìn)樣20 μL，結(jié)果表明：樣品在220 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下，各色譜峰保留時(shí)間適中，分離度良好，基線平整且色譜圖包含信息量較大，故選取220 nm 為高效液指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)[8-10]。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，每次進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得RSD 均＜3%，表明儀器精密度良好。利用SPSS 軟件進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一配伍（黃連:苦參=1:1）供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，每次進(jìn)樣20 μL，每隔2 h 分別進(jìn)樣2 次，測(cè)定各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得RSD 均＜3%。表明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定，利用SPSS 軟件進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一配伍（黃連:苦參=1:1）制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣2 次，每次進(jìn)20 μL，測(cè)定各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得RSD均＜3%。表明樣品重復(fù)性符合要求，利用SPSS 軟件進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。

2.4 指紋圖譜測(cè)定 分別精密吸取不同配伍的黃連、苦參合煎液和分煎混合液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按優(yōu)選的指紋圖譜梯度進(jìn)行洗脫，記錄90 min 的高效液相色譜圖（見(jiàn)圖1）和各色譜圖的峰面積、保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

圖1 不同比例配伍的供試品溶液指紋圖譜

表2 共有峰的相對(duì)峰面積

表3 共有峰的保留時(shí)間

2.4.1 共有峰面積 計(jì)算各樣品中的共有峰峰面積，求得各共有峰峰面積占總峰面積的百分比。見(jiàn)表4。

表4 共有峰面積的百分比

2.4.2 相似度計(jì)算 利用SPSS 軟件進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，相似度均＞0.9。見(jiàn)表5。

表5 相似度計(jì)算結(jié)果

2.4.3 共有峰的確定 比較不同比例配伍的黃連、苦參藥對(duì)的指紋圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)綜合分析最終確定以下18 個(gè)峰為指紋圖譜的共有峰（見(jiàn)圖2），其中峰7、8、9、10、11、12、13、14、15 來(lái)自于黃連，其余峰來(lái)自于苦參。因各比例中黃連為定量，分析各配伍比例來(lái)自黃連的共有峰的峰面積，得7、9、10、15 號(hào)共有峰的峰面積隨配伍比例的改變變化不大，14 號(hào)峰隨配伍比例的改變各共有峰峰面積有顯著性差異。將苦參取樣量轉(zhuǎn)換為3 g，分析得苦參中各共有峰峰面積受配伍比例的改變影響較大。

圖2 指紋圖譜共有峰

2.4.4 各共有峰的歸屬 將各對(duì)照品溶液按指紋圖譜梯度洗脫條件進(jìn)樣，得2 號(hào)峰為槐定堿，3 號(hào)峰為苦參堿，4 號(hào)峰為氧化苦參堿，12 號(hào)峰為藥根堿，13 號(hào)峰為巴馬汀，14 號(hào)峰為鹽酸小檗堿。

3 討論

實(shí)驗(yàn)建立了黃連-苦參的HPLC 指紋圖譜測(cè)定方法，利用指紋圖譜分析軟件，分析黃連-苦參水煎液7個(gè)不同比例配伍后樣品間的差異，來(lái)自黃連的7、9、10、15 號(hào)共有峰的峰面積隨配伍比例的改變變化不大，而14 號(hào)峰鹽酸小檗堿峰面積隨配伍比例改變有顯著性差異，來(lái)自苦參中的苦參堿、氧化苦參堿各共有峰峰面積受配伍比例的改變影響較大。本研究通過(guò)建立黃連-苦參藥對(duì)的HPLC 指紋圖譜，確定了15 個(gè)共有峰，并通過(guò)主要生物堿的含量測(cè)定分析出黃連-苦參的配伍變化的規(guī)律，能夠?qū)υ撍帉?duì)的質(zhì)量控制以及臨床使用提供參考。

綜上，本研究建立的黃連-苦參藥對(duì)的HPLC 指紋圖譜測(cè)定方法穩(wěn)定可靠，確定了15 個(gè)共有峰，能夠?qū)υ撍帉?duì)的質(zhì)量控制以及臨床使用提供參考。