徐龍飛， 張開學(xué)， 趙 飄， 王月霞*

(1. 六盤水師范學(xué)院，貴州 六盤水 553004； 2. 織金縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 織金 552100)

烏蒙鳳雞是六盤水市水城區(qū)紅巖鄉(xiāng)苗族同胞世代馴養(yǎng)的地方雞種，因冠羽較發(fā)達(dá)，雞頭像鳳凰而得名，具有覓食性能好，野外生存能力強(qiáng)，肉味鮮美等特點(diǎn)。該雞種由六盤水市農(nóng)委畜牧技術(shù)推廣站于2013年發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行保種、擴(kuò)繁和選育，目前已發(fā)展至近20 000羽。烏蒙鳳雞是烏蒙山區(qū)地方雞種質(zhì)新資源，目前國內(nèi)外尚無烏蒙鳳雞與貴州其他地方雞親緣關(guān)系的研究報道。本研究應(yīng)用分子系統(tǒng)學(xué)的DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)分析烏蒙鳳雞與威寧雞、高腳雞、緣鳳土雞、烏蒙烏骨雞4個烏蒙山區(qū)常見地方雞種的親緣關(guān)系，為該雞種的分子生物學(xué)鑒定方法和原始種群的擴(kuò)繁、選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料烏蒙鳳雞、威寧雞、高腳雞、緣鳳土雞、烏蒙烏骨雞由六盤水市農(nóng)委畜牧技術(shù)推廣站提供。分別采集5個地方雞種的腿部皮下組織10 g，浸于無水乙醇離心管中-80 ℃保存[1]。

1.2 主要試劑Buffer TL、Buffer BL、Buffer GW、Buffer EB、Buffer PP、96%～100%乙醇、ddH2O、GoldViewⅠ型核酸染色劑、EDTA-Na2、Tris緩沖溶液、動物組織基因組DNA提取試劑盒D1700(均購自北京索萊寶科技有限公司)；MarkerⅡ、2×TaqPCR Master MiX[均購自天根生化科技(北京)有限公司]。

1.3 引物(1)2組通用引物為P7/P8，BDNF-F/BDNF-R[2，3]。(2)采用Vector NTI Advan 10軟件對5個雞種基因組DNA的重測序存在SNP差異的2個區(qū)域設(shè)計(jì)2對引物；參考序列為雞的全基因序列(NCBI登錄號：AC270448.1)。2對設(shè)計(jì)引物由武漢百捷斯生物科技有限公司合成，引物信息見表1[4]。

表1 2對設(shè)計(jì)引物序列信息

1.4 方法

1.4.1 DNA提取參照鮑毅新等[5]、董明等[6]的動物組織DNA提取方法提取組織樣品的基因組DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增及測序采用通用引物P7/P8，BDNF-F/BDNF-R進(jìn)行第1次目的基因擴(kuò)增。采用突變位點(diǎn)的DNA設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第2次目的基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL：上、下游引物引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳目的條帶明亮、無雜帶，分子量大小通過MarkerⅡ比較判斷與預(yù)期設(shè)計(jì)的大小相同，則送至武漢百捷斯生物科技有限公司測序。

1.4.3 基因組DNA測序?qū)?個不同地方雞種的基因組DNA送至北京百邁客生物科技有限公司測序，使用DNA序列分析軟件bowtie和samtools獲得 5個不同地方雞種基因組DNA的SNP位點(diǎn)[7～9]。參考相關(guān)文獻(xiàn)，并用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10～12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 第1次目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析引物P7/P8擴(kuò)增的5個不同地方雞種的線粒體DNA基因組(Gallus mitochondrial DNA complete genome)基因片段無差別，引物BDNF-F/BDNF-R擴(kuò)增的5個不同地方雞種的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Gallus gallus brain-derived neurotrophic factor)基因片段也無差別(見圖1)。

圖1 第1次目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列

2.2 第2次目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析2組引物擴(kuò)增目的基因片段有差異(見圖2)，可以構(gòu)建親緣關(guān)系樹及計(jì)算遺傳距離[13]。

圖2 第2次目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列

2.3 構(gòu)建單基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.1 03號引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)分類，基于03號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種PCR產(chǎn)物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)，表明烏蒙鳳雞與威寧雞聚為1支，支持率為98%。

圖3 基于03號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種PCR產(chǎn)物系統(tǒng)發(fā)育樹注：支系旁的數(shù)值表示各支系的最大支持率，下圖同

2.3.2 07號引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹基于07號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種PCR產(chǎn)物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖4)，表明烏蒙鳳雞與高腳雞聚為1支，支持率為69%。

圖4 基于07號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種PCR產(chǎn)物系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 構(gòu)建多基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹由于單基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹所得出的結(jié)果差異較大，且支持率不高，所以將比對后的各個基因分別首尾相連，以同樣方法構(gòu)建多基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖5)。結(jié)果表明烏蒙鳳雞與威寧雞聚為1支，支持率為82%。

圖5 基于2個基因合并序列的5個不同地方雞種系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 遺傳距離分析

2.5.1 03號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種遺傳距離由表2可見：烏蒙鳳雞與威寧雞的遺傳距離為0，與烏蒙烏骨雞、高腳雞的遺傳距離為0.005，與緣鳳土雞的遺傳距離為0.007。烏蒙鳳雞與威寧雞的遺傳距離最近，與緣鳳土雞的遺傳距離最遠(yuǎn)。遺傳距離為0的物種可認(rèn)為是同一物種或者堿基差異不大。

表2 03號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種遺傳距離

2.5.2 07號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種遺傳距離由表3可見：烏蒙鳳雞與高腳雞的遺傳距離為0.001，與威寧雞、緣鳳土雞的遺傳距離為0.003，與烏蒙烏骨雞的遺傳距離為0.024。烏蒙鳳雞與高腳雞的遺傳距離最近，與烏蒙烏骨雞的遺傳距離最遠(yuǎn)。

表3 07號引物擴(kuò)增的5個不同地方雞種遺傳距離

2.5.3 2個基因合并序列的5個不同地方雞種遺傳距離由表4可見：烏蒙鳳雞與威寧雞的遺傳距離為0.001，與高腳雞的遺傳距離為0.003，與緣鳳土雞的遺傳距離為0.005，與烏蒙烏骨雞的遺傳距離為0.014。烏蒙鳳雞與威寧雞的親緣關(guān)系最近，與烏蒙烏骨雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表4 2個基因合并序列的5個不同地方雞種遺傳距離

3 結(jié)論

通過2個基因合并序列的系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離綜合分析，烏蒙鳳雞與威寧雞的親緣關(guān)系最近，與烏蒙烏骨雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

4 討論

采用DNA條形碼分析的初衷是用最簡單且可行的方法來鑒定物種。然而生物界的復(fù)雜性通常難以找到1種適用于所有類群的分子標(biāo)記，所以必須根據(jù)不同的類群設(shè)計(jì)出不同的分子標(biāo)記。另外，單一標(biāo)記不論是來自葉綠體基因組、線粒體基因組還是核基因組，都存在錯誤鑒定的危險。如果采用多基因標(biāo)記，產(chǎn)生錯誤的概率將會顯著降低。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，單基因與多基因的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定結(jié)果差異較大，雖然通過雙向測序及人工編輯，但其中還存在一些不明確的堿基序列，還需要增加樣品個數(shù)來校正測序誤差及雞種不純造成的誤差。本研究通過分子系統(tǒng)學(xué)綜合分析，在系統(tǒng)發(fā)育樹中烏蒙鳳雞與威寧雞親緣關(guān)系最近，但支持率不高，僅為82%，所以對其分子生物學(xué)鑒定還有待于進(jìn)一步研究核實(shí)。