孔令琳，鄭圣晗，陳 穎，朱鵬飛，吳 允，郭其新，陳國宏，常國斌

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009)

不同雞種DMA基因序列比較分析

孔令琳，鄭圣晗，陳 穎，朱鵬飛，吳 允，郭其新，陳國宏，常國斌*

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009)

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha)基因是雞MHC Ⅱ類典型基因座，與免疫反應(yīng)和抗病性密切相關(guān)。試驗(yàn)對25個(gè)不同雞種的DMA基因序列進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序，以NCBI上Gallusgallus的DMA基因序列作為參考序列，通過MEGA6軟件進(jìn)行序列比對分析，篩選出不同雞種DMA基因序列上的SNPs和Indels(insertion-deletion)位點(diǎn)以及氨基酸的變化，并根據(jù)基因序列的差異構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，探究不同雞種間的同源性。結(jié)果表明，DMA基因呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，突變和缺失位點(diǎn)集中于外顯子上，且多個(gè)雞種在第2外顯子發(fā)生多位堿基缺失，導(dǎo)致其氨基酸序列發(fā)生極大改變，可能是不同雞種產(chǎn)生抗性差異的主要因素；同時(shí)進(jìn)化樹也顯示，斗雞、藏雞等抗性較好的雞種間有相近的親緣關(guān)系，同源性較高。以上結(jié)果表明，DMA基因有豐富的遺傳多樣性，且與不同雞種的先天免疫與抗病特性差異相關(guān)，第2外顯子中94 496～94 552的Indels可以作為雞免疫特性的候選標(biāo)記。

雞；DMA基因；MHC；SNPs；Indels；進(jìn)化樹

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha)基因是雞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因家族一個(gè)Ⅱ類典型基因座。禽類MHC又被稱為B復(fù)合物，位于16號(hào)染色體，其結(jié)構(gòu)較哺乳動(dòng)物的MHC更加緊湊短小，核心區(qū)域BF/BL區(qū)包含19個(gè)基因，DMA即為其中一個(gè)典型基因座，位于ClassⅡ區(qū)[1]，與DMB1、DMB2基因合稱DM基因，都與抗原加工與呈遞有關(guān)，它們共同編碼DM分子，DMA與DMB分別編碼DM分子的α鏈和β鏈，研究發(fā)現(xiàn)，DM分子為非經(jīng)典分子，不像其他經(jīng)典ClassⅡ區(qū)分子一樣表達(dá)于細(xì)胞表面，而是作為Ⅱ類分子的分子伴侶在MHC Ⅱ類分子的抗原呈遞過程中起決定性作用，作用為移除恒定鏈并使外源性抗原結(jié)合到抗原槽中。由于DM分子所處位置及其特殊功能，與DM分子相關(guān)聯(lián)的疾病幾乎都與自身免疫有關(guān)，這表明DMA基因在免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮了一定的作用[2-3]。目前針對DMA基因的研究大多集中于人類或小鼠等哺乳動(dòng)物上，家禽這方面的研究相對較少，而雞作為人類的主要肉類來源之一，針對其抗性及抗病育種的研究都有重要意義。因此，本研究利用目標(biāo)捕獲測序法對25個(gè)不同雞種DMA基因序列進(jìn)行測序，探究抗性不同的雞種中DMA基因發(fā)生的SNPs、Indels并對其進(jìn)行系統(tǒng)分類比對分析，以探明該基因的遺傳多樣性，為家禽免疫遺傳學(xué)和抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

本研究共選取25個(gè)雞品種，其中白耳雞(BE)、茶花雞(CH)、大骨雞(DG)、斗雞(DJ)、固始雞(GS)、狼山雞(HL)、鹿苑雞(Lu)、泰和烏骨雞(WG)、仙居雞(XJ)、蕭山雞(XS)、北京油雞(YJ)、藏雞(ZJ)等12個(gè)地方雞種來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院家禽科學(xué)研究所，紅色原雞(HY)采自云南省野生動(dòng)物救護(hù)中心，安卡雞(AK)、廣西黃雞(GX)、 SPF-來航雞(SPF-LH)、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(LK)、羅斯雞(LS)、溧陽雞(LY)、青腳麻雞(QJ)、如皋黃雞(RG)、太湖雞(TH)、文昌雞(WC)、雪山雞(XC)、隱性白羽雞(YB)等12個(gè)雞種來自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室禽種資源基因庫。每個(gè)雞種隨機(jī)選取10羽雞，翅下靜脈采血2 mL，用苯酚-氯仿法提取DNA，DNA樣品濃度要求大于50 ng·μL-1，4 ℃冷藏保存。將DNA樣品送深圳華大基因公司(BGI)進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測序。

雞的MHC基因位于16號(hào)染色體上，針對此區(qū)域，進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，雞的MHC基因長約98 kb。針對此區(qū)域捕獲是利用SureSelectTargetEnrichment Kit定制試劑盒并按照Aglient(中國)公司的說明書通過基因組DNA與設(shè)計(jì)的RNA探針雜交完成的。將捕獲的基因組DNA運(yùn)用IlluminaHiSeq 2000測序儀進(jìn)行PE 100雙末端測序，測序的流程為：首先對樣本進(jìn)行濃度及完整性的檢測；質(zhì)檢合格后進(jìn)行文庫的構(gòu)建，運(yùn)用超聲破碎的技術(shù)將基因組打碎，回收長度約為500 bp的DNA片段，兩端進(jìn)行修復(fù)以及加接頭，橋式PCR完成文庫的構(gòu)建；庫檢合格后上機(jī)測序即可。

針對目標(biāo)捕獲測序結(jié)果的初始數(shù)據(jù)，首先去除reads中的接頭污染，然后將reads中超過50%的低質(zhì)量堿基去除(quality value ≤ 5 (E))，確保分析數(shù)據(jù)的高質(zhì)量性。以NCBI上Gallusgallus(GG)的DMA基因堿基序列為參考序列，利用MEGA6軟件對25個(gè)雞種的核苷酸序列與參考序列進(jìn)行比對，分析核苷酸突變位點(diǎn)和插入缺失位點(diǎn)以及氨基酸變化位點(diǎn)，最后運(yùn)用鄰接法(neighbour joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(phylogenetic tree)。

2 結(jié)果與分析

2.1DMA基因序列分析

本研究以NCBI上Gallusgallus的DMA基因(Gene ID: 417050)堿基序列為參考序列。由圖1可知，Gallusgallus的DMA基因位點(diǎn)為93 874～96 249，共2 210 bp，其中外顯子4個(gè)，內(nèi)含子3個(gè)。

2.2 不同雞種中DMA基因SNPs位點(diǎn)及Indels位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

目標(biāo)捕獲測序結(jié)果中目標(biāo)區(qū)域測序深度達(dá)6×以上，覆蓋度達(dá)89.2%。使用MEGA6軟件比對26段DMA基因序列(包括參考序列)后發(fā)現(xiàn)，DMA基因在25個(gè)雞種中共有52個(gè)SNPs和Indels位點(diǎn)，基本位于Exon2、Exon3、Exon4上，多數(shù)集中于Exon2，僅5個(gè)SNPs和Indels位點(diǎn)位于內(nèi)含子，可見DMA基因有較好的多態(tài)性(表1)。

2.3 DMA基因外顯子SNPs位點(diǎn)分布

由表2可知，25個(gè)雞種中，僅羅斯雞沒有SNPs位點(diǎn)，黑狼山雞、茶花雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞等雞種存在較少SNPs位點(diǎn)，而斗雞、固始雞、SPF-來航雞等雞種的SNPs位點(diǎn)較多，大部分突變位點(diǎn)為有義突變，這表明DMA基因的SNPs位點(diǎn)與雞種的抗病力密切相關(guān)，抗性較好的雞種SNPs普遍多于抗性差的雞種。

圖1 NCBI中紅色原雞DMA基因序列Fig.1 DMA gene sequences of Gallus gallus in NCBI

表1 不同雞種中DMA基因外顯子和內(nèi)含子核酸變化

Table 1 Nucleotide variations in exons and introns ofDMAgene

位置Sites范圍Range長度Length/bpSNPs及Indels個(gè)數(shù)NumbersofSNPsandIndels比例Percentage/%外顯子1Exon193874—9400012700外顯子2Exon294450—947162673412.73外顯子3Exon395639—9592028241.42外顯子4Exon496011—9624923993.77內(nèi)含子1Intron194001—9444944910內(nèi)含子2Intron294717—9563892240.53內(nèi)含子3Intron395921—960109000

表2 不同雞種中DMA基因在外顯子上的突變分布表

Table 2 SNPs distribution ofDMAgene in different breeds

雞種Breeds外顯子2Exon2位點(diǎn)SitesSNPs外顯子3Exon3位點(diǎn)SitesSNPs外顯子4Exon4位點(diǎn)SitesSNPsAK94669C/T95903C/A96059A/GBE94526;94669A/G;C/T95667;95903T/C;C/A96046;96085;96104G/A;C/T;C/TYJ94669C/T95646;95667;95903C/G;T/C;C/A96106C/ACH95646C/GDG96046;96106;96137G/A;C/A;C/TDJ94540;94554;94559;94565;94669G/A;A/G;G/A;A/G;C/T95646;95667C/G;T/C96046G/AGX94565;94669A/G;C/T95667;95903T/C;C/A96137C/TGS94540;94554;94559;94565G/A;A/G;G/A;A/G95667;95903T/C;C/A96106C/AHY95889T/C96046G/ALK95646C/G96108C/TSPF-LH94540;94554;94559;94565;94669;94710G/A;A/G;G/A;A/G;C/T;A/G95667;95903T/C;C/A96046G/AHL95646C/GLu95646;95903C/G;C/ALY94669C/T95646;95667;95903C/G;T/C;C/A96109G/CQJ94595;94669G/C;C/T95646;95903C/G;C/A96137C/TRG94669C/T95646;95903C/G;C/A96046G/ALSTH94669C/T95667;95903T/C;C/A96046G/AWC95667;95903T/C;C/A96046;96062;96085;96104G/A;T/C;C/T;C/TWG94669C/T95646;95889;95903C/G;T/C;C/A96106C/AXC95667;95903T/C;C/A96046G/AXJ95646C/GXS95646;95667;95903C/G;T/C;C/AYB95646C/G96137C/TZJ94669C/T95903C/A96059A/G

“/”前的為突變前的堿基，“/”后的為突變后的堿基。

The base before and after symbol “/” represents the base before and after mutation.

經(jīng)比對，25個(gè)不同雞種中Indels位點(diǎn)均存在于Exon2，由表3可見，共有15個(gè)雞種在94 497～94 511位點(diǎn)發(fā)生基因缺失，其中SPF-來航雞和固始雞在94 552～94 565位點(diǎn)也發(fā)生了缺失，而20個(gè)雞種在624位點(diǎn)都插入了一個(gè)堿基G，這些都導(dǎo)致DMA基因Exon2翻譯產(chǎn)物發(fā)生巨大的變化，顯示出極高的多態(tài)性。

2.4 不同雞種DMA基因進(jìn)化樹分析

將26個(gè)不同雞種(包括參考序列)DMA基因的完整序列整合為FASTA格式，利用MEGA6對25個(gè)雞品種的DMA基因序列與參考序列進(jìn)行對比分析，分析其同源性，如圖2，選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree(NJ)法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap的值設(shè)置成500。Bootstrap consensus tree如圖3。

由圖3可知26個(gè)雞種主要分為3大類，東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、茶花雞、狼山雞、隱性白羽雞、羅斯雞等雞種類聚在一起；泰和烏骨雞單獨(dú)為一類；斗雞、廣西黃雞、藏雞等抗性較好的中國地方雞種類聚在一起。上述結(jié)果表明，DMA基因在進(jìn)化過程中存在豐富的遺傳多樣性，可能對不同雞種的抗性產(chǎn)生了影響。

3 討論

MHC基因家族作為基因組中多態(tài)性最高的基因之一，其多態(tài)性與物種抵抗多種疾病的能力存在著密切的關(guān)系。DM基因的發(fā)現(xiàn)是由Cho等[4]通過對小鼠MHC(H2)黏粒的篩選得到3個(gè)新的Ⅱ類相關(guān)序列而來，這3個(gè)序列后被命名為H2-MA、MB1、MB2。隨后Kelly用探針5.22D和5.22C獲得了人HLA的cDNA克隆RING6和RING7，分別命名為HLA-DMA和DMB，目前在許多高等動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)了該基因的同源基因[5]。DMA基因所編碼的DM分子，在抗原加工呈遞過程中，作為經(jīng)典的MHC Ⅱ類分子的分子伴侶發(fā)揮重要作用。

表3 不同雞種DMA基因第二外顯子Indels分布表

Table 3 Indels distribution in exon2 ofDMAgene in different breeds

堿基起始位點(diǎn)InitiationsitesIndels堿基Bases雞種Breeds94496I1GLS、DJ、GS、ZJ、WG、XC、HY、XS、YB、CH、AK、YJ、DG、WC、TH、LY、LK、GX、XJ、BE94497D14ACATCAGTGGGGACZJ、AK、QJ、DG、DJ、WC、YB、XS、CH、LU、RG、YJ、BE、SPF-LH、GS94552D14ACACATCGGTGGGASPF-LH、GS

D和I分別表堿基缺失和插入，后面帶的數(shù)字表示堿基數(shù)，即I1表示有1個(gè)堿基插入。

D and I represents base deletion and insertion， the followed number represents the base number， for example， I1 represents there was one base insertion.

圖2 二十五個(gè)雞種間親緣關(guān)系分析Fig.2 Genetic relationship analysis of 25 chicken breeds

圖3 不同雞種NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of different breeds

本研究結(jié)果表明，DMA基因的4個(gè)外顯子中，Exon2、Exon3、Exon4上均存在堿基的突變和缺失，Exon1高度保守，多態(tài)性主要集中于Exon2，尤其Exon2上多個(gè)雞種發(fā)生基因缺失導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生巨大變化，顯示出DMA基因極高的多態(tài)性，且與不同雞種的抗病力和環(huán)境適應(yīng)力直接相關(guān)，這與MHC Ⅱ類D區(qū)中經(jīng)典基因的多態(tài)主要集中在外顯子2的結(jié)論相符。而關(guān)于豬的DMA基因相關(guān)研究卻并未得出相同結(jié)論，這可能與物種差異有關(guān)[6]。其中羅斯雞沒有發(fā)生位點(diǎn)突變，僅發(fā)生一個(gè)位點(diǎn)插入，隱性白羽雞也基本沒有SNPs位點(diǎn)，這可能與它們是國外雞種，且生長速度快、性成熟早，抗性差有關(guān)。黑狼山雞等中國地方雞種DMA基因序列上的突變位點(diǎn)也相對較少，可能與保種群體相對較小有關(guān)。斗雞、藏雞、固始雞這類抗病力好、抗逆性強(qiáng)的中國地方雞種序列上SNPs位點(diǎn)相對較多。25個(gè)雞種中有80%在第2外顯子的94 496位點(diǎn)有堿基插入，藏雞、安卡雞、青腳麻雞、大骨雞、斗雞、文昌雞、隱性白羽雞、蕭山雞、茶花雞、鹿苑雞、如皋黃雞、北京油雞、白耳雞、SPF-來航雞、固始雞均在94 497發(fā)生了14位Indels，其中固始雞和SPF-來航雞在94 552位點(diǎn)又發(fā)生14位Indels，這些可能都與DMA基因所編碼的DM分子在免疫應(yīng)答中所處位置與作用有關(guān)，可將第2外顯子中94 496～94 552的Indels可以作為雞免疫特性的候選標(biāo)記。其余外顯子及內(nèi)含子的多態(tài)位點(diǎn)則十分有限，這可能與DMA基因并非Ⅱ類經(jīng)典基因，進(jìn)化上更為保守有關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化樹將斗雞、藏雞、固始雞這一類抗性好、適應(yīng)性強(qiáng)的雞種與羅斯雞等外來雞種明顯分開，這進(jìn)一步表明了DMA基因多樣性能真實(shí)反映不同雞種的起源與遺傳背景。隱性白羽雞、羅斯雞等外來雞種與我國地方雞種并沒有形成單獨(dú)分類，這可能與這些國外雞種是由我國部分雞種如黑狼山雞雜交育成有關(guān)，在進(jìn)化樹上的位置也離黑狼山雞比較近。文昌雞、大骨雞在進(jìn)化樹上與其余雞種的位置都相對較遠(yuǎn)，這可能與它們的原產(chǎn)地位置偏僻有一定的聯(lián)系。泰和烏骨雞單獨(dú)分為一類可能與其獨(dú)特的血型有關(guān)[7]，其余中國地方雞種分布無明顯規(guī)律。

Nikolich-zugich等[8]發(fā)現(xiàn)，雞MHC基因多態(tài)性和多種傳染性疾病的遺傳抗性高度相關(guān)。目前針對雞的DMA基因的研究報(bào)道還相對較少，哺乳動(dòng)物這方面的研究比較透徹。事實(shí)上雞MHC上所有基因在哺乳動(dòng)物MHC上都有對應(yīng)基因，雞DMA基因與哺乳動(dòng)物DMA基因?qū)儆谥毕低椿?。國際HLA因子命名委員會(huì)已認(rèn)定的DMA和DMB基因的有限等位基因與Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病均存在顯著的相關(guān)性，且在不同人種中分布頻率存在一定的差異。許多研究發(fā)現(xiàn)DM可能與機(jī)體保護(hù)性的免疫反應(yīng)和自身免疫均有關(guān)聯(lián)。Toussirot等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DMA基因是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的正性相關(guān)基因，且與發(fā)病相關(guān)部位內(nèi)皮下淋巴結(jié)有關(guān)。桑艷梅等[10]發(fā)現(xiàn)，DM基因與Ⅰ型糖尿病的相關(guān)性之間存在一定的劑量效應(yīng)規(guī)律。Morel等[11]發(fā)現(xiàn)，HLA-DM基因多態(tài)性對SLE的發(fā)生有一定的影響。磨美蘭等[12]通過對SLA-DM等Ⅱ類分子表達(dá)研究，表明豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染早期對豬肺泡巨噬細(xì)胞的外源性抗原加工和遞呈功能產(chǎn)生顯著影響，導(dǎo)致其外源性抗原遞呈功能下降，進(jìn)而影響機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。關(guān)于雞DMA基因與疾病間相關(guān)性的研究尚不多見，仍有很大的空間。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Comparative analysis ofDMAgene sequences in different chicken breeds

KONG Linglin， ZHENG Shenghan， CHEN Ying， ZHU Pengfei， WU Yun， GUO Qixin， CHEN Guohong， CHANG Guobin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha) is a typical gene of chicken MHC class Ⅱ， which is closely related to the host immune response and disease resistance. In this study， we detectedDMAgene of 25 different chicken breeds by target capture sequencing and usedDMAgene sequence ofGallusgallusin NCBI as the reference. Then we analyzed gene sequence by MEGA6， screened SNPs (single nucleotide polymorphism) and Indels (insertion-deletion) ofDMAgene sequences in different chicken breeds. Finally， we constructed the phylogenetic tree according to the differences in gene sequences. The results revealed that theDMAgene appeared rich polymorphism. SNPs and Indels were concentrated on exons mostly. Meanwhile， base deletions on exon2 caused the great changes in its translated products. In addition， the phylogenetic tree showed the chickens with better disease resistance such as Tibetan chicken and game chicken had high homology. The above results demonstrated that theDMAgene is rich in genetic diversity which is related to the differences in innate immunity and disease resistance in chicken breeds. The Indels in exon 2 94 496-94 552 can be used as a candidate marker of chicken immune characteristics.

chicken;DMAgene; MHC; SNPs; Indels; phylogenetic tree

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.07

2016-11-02

國家科技支撐計(jì)劃(2015BAD03B03)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

孔令琳(1994—)，女，江蘇揚(yáng)州人，碩士研究生，從事家禽遺傳育種研究。E-mail:1921714112@qq.com

*通信作者，常國斌，E-mail: passioncgb@163.com

S831

A

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浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 560-565

孔令琳，鄭圣晗，陳穎，等. 不同雞種DMA基因序列比較分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(4)： 560-565.