王曉童 向 麗 鄔 蘭 高冉冉

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/青蒿素中心，北京，100700； 2 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱，150040)

黃芩(Scutellariae Radix)是我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，其基原植物為唇形科(Lamiaceae)植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)[1]。研究表明黃芩地上和地下部分積累不同的黃酮類活性成分，地上主要積累野黃芩苷、野黃芩素、芹菜素、木樨草素等，地下主要積累黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等4′-脫氧類黃酮[2]。黃芩及其黃酮類活性成分均具有良好的臨床藥用價值，在新型冠狀病毒肺炎的治療中，黃芩作為傳統(tǒng)中藥發(fā)揮重要作用，是《新型冠狀病毒診療方案》中“清肺排毒湯”“宣肺潤燥解毒方”的成分之一[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩提取物可以體外抑制新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)中的蛋白酶3CLpro活性和SARS-CoV-2在Vero細(xì)胞中的復(fù)制[4]。此外，黃芩素及黃芩苷等成分被報道具有改善飲食引起的肥胖和肝脂肪變性、抗菌等活性。因此，揭示黃芩中調(diào)控黃酮類活性成分生物合成的轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控機制，對于培育高黃酮含量的黃芩種質(zhì)、黃芩相關(guān)藥物研發(fā)等具有重要價值。

MYB轉(zhuǎn)錄因子(v-Myb禽成髓細(xì)胞病病毒癌基因同源物)是植物界中數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其在N端含有一段能夠與DNA結(jié)合的高度保守的基序，該基序通常由1～4個不完整的重復(fù)片段組成，每個重復(fù)片段50～53個氨基酸，組成3個α-螺旋并形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(Helix-turn-helix，HTH)結(jié)構(gòu)，MYB轉(zhuǎn)錄因子通過HTH結(jié)構(gòu)插入到靶DNA的大溝中進行結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達。依據(jù)重復(fù)序列的數(shù)量和種類，MYB可分為4個亞族：1R-MYB、2R-MYB(R2R3-MYB)、3R-MYB和4R-MYB，R2R3-MYB是數(shù)量最多、功能也最為廣泛的亞族[5-7]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是目前研究較多的轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、抗逆脅迫、次級代謝產(chǎn)物的積累。已報道研究中，MYB參與調(diào)控植物黃酮類成分合成的報道居多，如蘋果(Malusdomestica)MdMYB9和MdMYB11都能與花青素合成酶(Anthocyanin Synthetase，ANS)、花青素還原酶(Anthocyanidin Reductase，ANR)和無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin Reductase，LAR)的啟動子結(jié)合，調(diào)控花青素和原花青素的積累[8]；蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中的MYB轉(zhuǎn)錄因子MtLAP1可以結(jié)合MtGSTF7啟動子區(qū)來激活其表達，從而調(diào)控蒺藜苜蓿中花青素的積累[9]；擬南芥(Arabidopsisthaliana)、龍膽(Gentianatriflora)中的MYB轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控黃酮類成分的積累[10-12]。

迄今為止，黃芩活性成分合成的調(diào)控機制鮮有報道。目前報道的黃芩中參與黃酮類化合物合成的SbMYB只有3個[13-14]。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，黃芩的全基因組測序已經(jīng)完成[15-16]，黃芩中黃酮類活性成分的生物合成途徑及關(guān)鍵酶已基本解析[17-19]，基于全基因組的SbMYB轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)分析和研究提上日程。本研究首次基于黃芩的全基因組對其中MYB轉(zhuǎn)錄因子進行系統(tǒng)鑒定和分析，預(yù)測可能參與黃酮類化合物生物合成相關(guān)的調(diào)控基因，為深入研究黃芩中黃酮類成分合成的調(diào)控機制提供支撐。

1 材料與方法

1.1 基因家族的鑒定 黃芩基因組在the Genome Warehouse(https://bigd.big.ac.cn/gwh)下載(登錄號：GWHAOTO00000000)。采用以下2種方法進行SbMYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定：1)從PFAM數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載MYB轉(zhuǎn)錄因子特有的保守結(jié)構(gòu)域模型(PF00249)，使用HMMER軟件在黃芩基因組數(shù)據(jù)庫中進行搜索，E-value設(shè)為e-5；2)從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)下載168條擬南芥AtMYB蛋白序列，通過本地BLAST，與黃芩基因組數(shù)據(jù)庫進行同源比對。將二者的比對結(jié)果整合，使用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和PFAM蛋白數(shù)據(jù)庫進行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。通過PROSITE(http://www.expasy.org/prosite/)針對篩選出的SbMYB轉(zhuǎn)錄因子進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測。通過WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對SbMYB進行亞細(xì)胞定位分析。

1.2 基因家族分類與系統(tǒng)發(fā)育樹 為研究黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化關(guān)系并確定其亞族分類，以模式物種擬南芥為參考，利用最大似然法對168條AtMYB和146條SbMYB蛋白的全長序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列與MAFFT進行比對，比對結(jié)果使用IQ-TREE2.0.3構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹，MFP參數(shù)選擇最優(yōu)模型，BOOTSTRAP設(shè)為1 000次。系統(tǒng)發(fā)育樹在ITOL在線網(wǎng)站(https://itol.embl.de/)進行編輯。根據(jù)黃芩與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對黃芩SbMYB基因家族成員進行亞族分類。

1.3 基因結(jié)構(gòu)與染色體分布分析 從黃芩基因組注釋文件中提取146個SbMYB基因的注釋信息，將其提交到GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/index.php)網(wǎng)站進行基因結(jié)構(gòu)分析，確定基因的內(nèi)含子數(shù)量，并繪制內(nèi)含子和外顯子模式圖。從SbMYB基因注釋文件中獲取基因位置信息，并進行統(tǒng)計整理，使用Tbtools進行可視化分析。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域與基序分析 采用基序誘導(dǎo)多個最大期望值(Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation，MEME)在線軟件(http://meme-suite.org/)對SbMYB的保守基序進行分析。參數(shù)設(shè)置為：同一基序在一條序列中出現(xiàn)的次數(shù)為“any”，基序長度范圍6～100個氨基酸殘基，基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目15個，其他參數(shù)為默認(rèn)值。將以上結(jié)果與PFAM數(shù)據(jù)庫獲得的保守結(jié)構(gòu)域信息一同提交到ITOL網(wǎng)站進行可視化分析。

1.5 基因表達模式分析 根據(jù)黃芩SbMYB轉(zhuǎn)錄因子在根、莖、葉和花4個不同組織中編碼基因的表達量FPKM值，繪制SbMYB轉(zhuǎn)錄因子在不同組織部位的表達量熱圖。黃芩中黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被注釋[17]，篩選15個已驗證有功能或表達量高的黃酮類化合物合成相關(guān)基因(SbPAL3、SbC4H1、SbCLL-1、SbCLL-5、Sb4CLL7-1、Sb4CLL8、Sb4CLL10、SbCHS1、SbCHI、SbFNSII1、SbFNSII2、SbF6H1、SbF8H、SbF6H2、SbUBGAT)，根據(jù)已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取這15個基因在根、莖、葉和花中的表達量，與SbMYB轉(zhuǎn)錄因子繪制表達量熱圖。所有熱圖均在在線網(wǎng)站(https://www.omicstudio.cn/tool)繪制，F(xiàn)PKM值進行“+1”預(yù)處理后，取log2值，并對基因進行聚類分析。

1.6 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了進一步研究SbMYB轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因間調(diào)控關(guān)系，本研究將所有SbMYB和高表達的黃酮類化合物合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因蛋白序列提交String(https://www.string-db.org/)進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)預(yù)測，預(yù)測結(jié)果使用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。篩選FPKM值大于5的SbMYB轉(zhuǎn)錄因子，使用Omicstudio平臺的Cor工具計算SbMYB轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因間的相關(guān)性，構(gòu)建無向量網(wǎng)絡(luò)圖。相關(guān)性系數(shù)絕對值大于0.8，皮爾遜相關(guān)系數(shù)(p-value)小于0.05。

2 結(jié)果

2.1 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的篩選與鑒定 本研究共鑒定得到146條SbMYB蛋白序列。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析表明，各成員的氨基酸序列長度在87 aa(SbMYB106)～957 aa(SbMYB105)之間，平均分子質(zhì)量在9 884.46(SbMYB109)～107 846.15(SbMYB105)之間。蛋白質(zhì)等電點大于(堿性蛋白質(zhì))和小于(酸性蛋白質(zhì))7的成員數(shù)量分別為90和56個，說明大多數(shù)為堿性蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)均小于100，親水系數(shù)均為負(fù)值，不穩(wěn)定系數(shù)小于40的蛋白序列僅5個(SbMYB55、SbMYB81、SbMYB109、SbMYB117、SbMYB137)，表明SbMYB蛋白多為親水性不穩(wěn)定蛋白。WoLF PSORT預(yù)測結(jié)果顯示，144個SbMYB定位在細(xì)胞核中，SbMYB143、SbMYB120分別定位在線粒體和葉綠體中。見表1。

表1 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子家族信息

續(xù)表1 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子家族信息

續(xù)表1 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子家族信息

續(xù)表1 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子家族信息

2.2 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進化分析 最大似然法構(gòu)建擬南芥和黃芩MYB蛋白全長序列系統(tǒng)發(fā)育樹，自動選擇最佳模型為VT+R6，進化樹分枝上的圓圈代表支持率(%)，圓圈越大，相應(yīng)的支持率也增大。結(jié)果顯示，根據(jù)與擬南芥的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，黃芩146個SbMYB轉(zhuǎn)錄因子可以劃分為4個亞族(1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB)和一個未分族成員(SbMYB117)。其中，R2R3-MYB亞族成員數(shù)量最多，有116個，占總SbMYB轉(zhuǎn)錄因子的79.45%；1R-MYB有26個，占總SbMYB的17.81%，是黃芩SbMYB家族中的第二大亞族；3R-MYB、4R-MYB亞族成員數(shù)量較少，分別有2個和1個。見圖1。

圖1 黃芩和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化樹

2.3 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)分析及其染色體定位 根據(jù)基因組注釋信息，繪制了SbMYB轉(zhuǎn)錄因子的外顯子和內(nèi)含子模式圖。SbMYB外顯子數(shù)目2～19個，表明不同的SbMYB成員在基因結(jié)構(gòu)上存在多樣性和顯著差異。同一SbMYB亞族內(nèi)的外顯子數(shù)量較為保守，R2R3-MYB亞族成員大都含有2～3個外顯子，外顯子長度和位置也較為相近；1R-MYB、3R-MYB、4R-MYB亞族成員的外顯子數(shù)目明顯多于R2R3-MYB，大部分含有4～6個外顯子。不同亞族之間外顯子的位置和長度存在差異。見圖2A。

圖2 SbMYB的基因結(jié)構(gòu)(A)與染色體分布(B)

依據(jù)從黃芩基因組注釋文件中獲取的SbMYB位置信息，繪制SbMYB染色體定位圖。145個SbMYB轉(zhuǎn)錄因子隨機不均勻分布在9條染色體上(chr1～chr9)，其中大多數(shù)SbMYB定位在chr1和chr2上(36個和27個)，chr6(8個)、chr7(7個)和chr9(7個)上分布較少，SbMYB106未定位到染色體上，而定位在未掛載到染色體的contig上，這與基因組的染色體組裝有關(guān)。見圖2B。

2.4 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域與基序分析 本研究對SbMYB進行保守結(jié)構(gòu)域分析，共預(yù)測到4個MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域，命名為MYB Domian1-4。所有的SbMYB至少含有1個MYB保守結(jié)構(gòu)域。1R-MYB大都僅含1個MYB Domian1，部分成員還含有MYB Domian3，且MYB Domian3僅在1R-MYB中存在。R2R3-MYB中，最保守的結(jié)構(gòu)域組成含有2個MYB Domian1，很少部分成員僅含有1個MYB Domian2。3R-MYB均含有3個MYB Domian，但組成不同，SbMYB2含有1個MYB Domian2。見圖3A。

同一基因家族的成員，其基序組成通常較為保守，且進化關(guān)系較近的成員間具有相似的基序組成。我們在SbMYB轉(zhuǎn)錄因子中共預(yù)測到15個保守基序(Motif)，命名為Motif1-15。不同亞族之間SbMYB基序組成存在差異，同一亞族SbMYB成員具有相似數(shù)目和類型的基序組成。1R-MYB亞族的保守基序為Motif7，它可能與Motif5或Motif13共同組成MYB Domian3；R2R3-MYB亞族中，Motif1、Motif2、Motif3和Motif4是其最保守的基序，依照其在基因位置上與MYB結(jié)構(gòu)域的對應(yīng)關(guān)系，Motif1-4可能是MYB Domian1的代表基序；3R-MYB亞族的保守基序為Motif1、Motif2、Motif3和Motif11；4R-MYB亞族僅預(yù)測到Motif3。見圖3B。

圖3 黃芩MYB基因保守結(jié)構(gòu)域(A)與基序(B)分析

2.5 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因表達模式分析 基于黃芩根、莖、葉、花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進一步分析SbMYB在不同器官中的表達模式，結(jié)果表明，SbMYB在不同器官中具有不同的表達模式。根、莖、葉中表達模式相似，與花中的表達模式差異較大。見圖4A。對SbMYB與黃酮類化合物合成結(jié)構(gòu)基因之間的表達模式分析顯示，黃酮類化合物合成相關(guān)基因大都與R2R3-MYB聚類在同一枝，表明R2R3-MYB亞族更可能參與黃酮類化合物的調(diào)控。此外Sb4CLL10、Sb4CLL7-1、SbFNSII1分別與SbMYB120、SbMYB127、SbMYB126聚在同一枝，說明黃酮類化合物合成相關(guān)基因可能也受到1R-MYB的調(diào)控。見圖4B。

圖4 不同組織中的基因表達分析

2.6 黃芩MYB轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過在轉(zhuǎn)錄組水平上對SbMYB與15個黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因間的相關(guān)性進行分析，構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，15個黃酮類化合物合成相關(guān)基因均與43個SbMYB存在強相關(guān)性(|r|>0.8)，說明它們之間可能存在調(diào)控關(guān)系。大多數(shù)SbMYB(38個)具有正調(diào)控作用，少部分SbMYB(9個)具有負(fù)調(diào)控作用。根據(jù)節(jié)點大小可以看出，SbCHI可能受SbMYB強調(diào)控作用，且大多為正調(diào)控。見圖5A。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，有8個黃酮類化合物合成相關(guān)基因與SbMYB可能存在相互作用關(guān)系；部分SbMYB之間也有潛在的互作關(guān)系(如：SbMYB100和SbMYB117)，說明SbMYB之間可能形成蛋白復(fù)合體共同調(diào)節(jié)下游基因的表達。見圖5B。

3 討論

藥用植物活性成分是發(fā)揮其藥效的重要基礎(chǔ)，主要來源于萜類、黃酮類、生物堿類等次生代謝產(chǎn)物的生物合成。由于植物次生代謝產(chǎn)物含量少、復(fù)雜多樣、分離困難等因素限制了藥用植物的發(fā)展和應(yīng)用。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子是植物代謝合成過程中的重要調(diào)控元件[20]，通過與序列特異性DNA結(jié)合和PPI調(diào)節(jié)特定基因表達，可以作為基因表達的激活劑或抑制劑，參與次生代謝物的合成和積累，獲取高價值次生代謝產(chǎn)物[21-22]。

圖5 SbMYB轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類化合物合成相關(guān)基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

隨著黃芩基因組的公布，黃芩的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族已被系統(tǒng)鑒定與分析[23]。MYB是植物中家族最龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，以R2R3-MYB亞族數(shù)量最多，R2R3-MYB也是報道具有最多生物學(xué)功能的亞族[24]。本研究基于黃芩的基因組數(shù)據(jù)，注釋出146個MYB轉(zhuǎn)錄因子，其中R2R3-MYB亞族有116個，1R-MYB、3R-MYB、4R-MYB亞族成員分別有26個、2個和1個，這與擬南芥、水稻、葡萄等物種中各亞族MYB的數(shù)量分布情況相似[5-6,25]；保守結(jié)構(gòu)域和基序分析表明，不同亞族間具有不同的結(jié)構(gòu)域和基序組成，這可能與MYB轉(zhuǎn)錄因子功能和調(diào)控作用方式有關(guān)。如：R2R3-MYB和3R-MYB通過R2、R3 MYB結(jié)構(gòu)域特異結(jié)合DNA序列，而1R-MYB一般僅含1個MYB保守結(jié)構(gòu)域，可能以不同的方式結(jié)合到DNA序列上，如與端粒結(jié)合，在維持染色體穩(wěn)定性中具有重要作用[26-27]。

已有較多研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物黃酮類次生代謝產(chǎn)物合成，PpMYB10.1是紅皮桃(Prunus persica)花青素積累的主要調(diào)節(jié)因子，并激活PpUFGT轉(zhuǎn)錄[28]；擬南芥AtMYB12和葡萄(Vitis vinifera)VvMYBF1被鑒定為黃酮醇特異性激活劑，AtMYB12轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)基因番茄(Solanum lycopersicum)中可以產(chǎn)生大量的黃酮醇[29-31]。黃芩中黃酮類成分的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究仍比較薄弱，Yuan等[13-14]研究人員前期從黃芩cDNA中篩選出19個SbMYB，并通過轉(zhuǎn)基因煙草實驗證明了SbMYB2、SbMYB7和SbMYB8可影響轉(zhuǎn)基因煙草中黃酮類化合物相關(guān)基因(NtPAL1、NtPAL2、NtC4H和NtUFGT)的轉(zhuǎn)錄水平從而影響黃酮類化合物的積累。目前黃芩中黃芩素、野黃芩素、漢黃芩素及其糖苷類黃酮成分的生物合成途徑及關(guān)鍵酶已經(jīng)解析，本研究通過Cor函數(shù)計算SbMYB與黃酮類化合物生物合成結(jié)構(gòu)基因間的相關(guān)性，并預(yù)測它們之間潛在的PPI關(guān)系，構(gòu)建了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而預(yù)測到SbMYB轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類化合物合成通路上結(jié)構(gòu)基因間潛在的調(diào)控關(guān)系?？赡軈⑴c黃酮類化合物生物合成的43個SbMYB轉(zhuǎn)錄因子中，38個SbMYB可能參與正調(diào)控，9個SbMYB可能參與負(fù)調(diào)控。

通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子對代謝途徑上關(guān)鍵酶活性的調(diào)控作用，從整體角度調(diào)控代謝途徑以獲得高產(chǎn)量目標(biāo)產(chǎn)物具有重要的科學(xué)價值。然而轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控植物次級代謝產(chǎn)物的合成與積累是一個復(fù)雜的研究體系，如蘋果(Malusdomestica)中MdMYB308L可以與MdbHLH33相互作用，增強其與MdCBF2和MdDFR啟動子結(jié)合，正向調(diào)控蘋果花青素的積累，蘋果的泛素連接酶(MdMIEL1)還可以與MdMYB308L互作，促進MdMYB308L降解從而負(fù)調(diào)控花青素積累[32]，因此，揭示其復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控模式是未來的一項重要任務(wù)。本研究為黃芩中參與黃酮類成分生物合成調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子篩選提供重要參考，在后續(xù)研究中，要結(jié)合先進的分子生物學(xué)技術(shù)，強化對重要SbMYB轉(zhuǎn)錄因子的機制解析。