王曉瑜 繆志偉 張耀輝 張春雨 徐 艷

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬張家港醫(yī)院脾胃病科，江蘇張家港 215600

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是慢性、反復(fù)發(fā)作性的胃腸道炎癥性疾病，現(xiàn)已發(fā)展成為全球性疾病[1-2]。2015 年，全球的炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者達到500 萬人，包含中國在內(nèi)的發(fā)展中國家發(fā)病例數(shù)急劇上升，且增長速度超過了西方國家[3-5]。據(jù)推測，到2025 年，僅在我國，將會有100 萬例患者罹患UC[4]，屆時將會對社會公共衛(wèi)生帶來巨大負擔(dān)。

現(xiàn)階段，UC 的確切發(fā)病機制仍然不明，涉及多個細胞通路，Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）4/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）6/核因子（nuclear transcrip tion factor，NF）-κB 通路即是最為經(jīng)典的信號通路之一。UC 發(fā)病過程中，機體遇到致病因素侵襲時，先天性免疫應(yīng)答最先啟動，腸黏膜細胞中的TLR4 過度表達，從而激活TRAF6，活化的TRAF6 合成K63 連接的泛素鏈介導(dǎo)了下游蛋白激酶復(fù)合體NF-κB 抑制蛋白激酶亞基α，從而引起IκBα 的磷酸化，并進一步降解，釋放NF-κB 進入細胞核，導(dǎo)致機體中的多種致病因子如促炎因子、趨化因子及黏附因子的釋放，引起免疫系統(tǒng)的失衡與紊亂，從而引起炎癥損傷，誘發(fā)UC。由此可見，TRL4/TRAF6/NF-κB 這條信號通路在UC的發(fā)病過程中起到至關(guān)重要的作用，若能阻斷這條通路，可減弱UC 的炎癥反應(yīng)。已有多項實驗證明，中草藥能夠通過調(diào)控這一通路，達到改善UC 的治療作用[6-8]。

經(jīng)多年臨床實踐總結(jié)，活動期UC 總離不開“熱、瘀”兩大病理因素，從而總結(jié)出經(jīng)驗方——清腸湯，其清熱祛濕、活血化瘀、涼血止血，能顯著提高UC 患者的治療有效率[9-10]。本研究通過采用清腸湯聯(lián)合美沙拉嗪治療熱盛血瘀型活動期UC，觀察其臨床療效及對TRL4/TRAF6/NF-κB 的影響，評價清腸湯的治療效果，探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年10 至2019 年12 月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬張家港醫(yī)院就診（門診及住院）的熱盛血瘀型活動期UC 患者60 例。按照隨機數(shù)字表法分為兩組，對照組30 例，單用西藥治療；治療組30 例，在對照組的基礎(chǔ)上予清腸湯治療。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018 年·北京）》[11]制定的UC 活動期診斷標準，且為輕-中度患者（改良Mayo 評分為3～10 分）。

1.2.2 中醫(yī)診斷標準 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[12]及《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》[13]制定熱盛血瘀證UC 的中醫(yī)診斷標準。主癥：①腹痛，腹瀉，膿血便，血色紫暗或黑；②里急后重；③腹痛灼熱；④舌質(zhì)暗紅，或有瘀斑瘀點，苔黃膩。次癥：①肛門灼熱；②溲赤；③脈弦滑或弦澀。符合主癥2 項及次證2 項即可診斷為熱盛血瘀證。

1.3 納入標準

①符合以上中西醫(yī)診斷標準；②年齡18～65 歲；③簽署知情同意書；④經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬張家港醫(yī)院倫理委員會審核通過，批準文號為2017KY056。

1.4 排除標準

①妊娠、哺乳期，或正準備妊娠的婦女；②過敏體質(zhì)及對本研究藥物已知成分或其他成分過敏；③有原發(fā)性心、肝、肺、腎、血液或影響其生存的嚴重疾??；④目前正參加其他臨床試驗。

1.5 研究方法

對照組：美沙拉嗪緩釋顆粒：1 g/次，4 次/d（上海愛德發(fā)制藥有限公司，生產(chǎn)批號：181005）。

治療組：在對照組方案的基礎(chǔ)上，服用清腸湯，方藥組成：白頭翁10 g、川黃柏10 g、生大黃6 g 后下、敗醬草15 g、仙鶴草15 g、地榆炭10 g、煨木香10 g、白及10 g、三七10 g、血竭沖服5 g、生甘草5 g。濃煎200 ml，口服，2 次/d。兩組療程均為3 個月。

1.6 觀察指標

分別于治療前及治療后1 周各觀察記錄一次。（1）主要療效指標：臨床療效。（2）次要療效指標：①中醫(yī)證候積分；②Mayo 評分；③腸鏡黏膜愈合率；④相關(guān)理化指標：腸鏡下黏膜組織的免疫熒光染色分析TLR4 表達量；免疫組織化學(xué)分析TRAF6、NF-κB 的表達量。

1.7 療效評價標準

①參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》[13]：治療后1 周Mayo 總評分≤2 分，則判定為臨床緩解；治療后1 周Mayo 總評分下降≥30%或≥3 分，且便血評分下降≥1 分，則判定為臨床有效；治療后1 周Mayo 總評分無降低，則判定為臨床無效。②中醫(yī)證候療效標準參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[12]。見表2。③內(nèi)鏡下腸道黏膜愈合標準：參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》[13]，Mayo 內(nèi)鏡亞評分為0 分或1 分。內(nèi)鏡黏膜愈合率=黏膜愈合人數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%。④免疫組化檢測結(jié)果的判定：結(jié)腸組織采用Roche 公司Ventena 全自動免疫組織化學(xué)檢測儀檢測，兔單克隆抗體（抗TRAF6ab33915、抗NFκB p65 ab32536）均購自Abcam 公司。使用Photoshop CS5 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞染色的積分光密度進行計算，結(jié)果以光密度（optical density，OD）值表示。⑤免疫熒光染色的測定：TLR4 抗體（ab22048）及熒光二抗山羊抗小鼠IgG H&L（ab150113）均購自Abcam 公司。結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟后在100℃檸檬酸鈉中加熱20 min，PBS 洗玻片，5 min 重復(fù)3 次，置于0.2% Triton 穿孔2 min，放入5%牛血清中封閉1 h，加入TLR4（1∶100），4℃過夜，PBS 洗玻片，5 min 重復(fù)3 次，黑暗中敷熒光二抗（1:500）50 min，PBS 洗5 min，漂洗3 次，加DAPI 封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。使用Photoshop CS5 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞染色進行計算。

表2 癥狀積分標準

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗。等級資料比較采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較

治療組臨床療效優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組臨床療效比較（例）

2.2 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較

治療前，兩組中醫(yī)證候單項積分及總積分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組中醫(yī)證候單項積分及總積分均較治療前降低，且治療組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較（分，）

表4 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較（分，）

2.3 兩組治療前后Mayo 評分比較

治療前，兩組Mayo 評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組Mayo 評分均較治療前降低，且治療組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組治療前后Mayo 評分比較（分，）

表5 兩組治療前后Mayo 評分比較（分，）

2.4 兩組內(nèi)鏡黏膜愈合率比較

治療組黏膜愈合率為86.67%（26 例），對照組為53.33%（16 例）。治療后治療組黏膜愈合率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝7.937，P＝0.005）。

2.5 兩組治療前后結(jié)腸黏膜TRAF6、NF-κB 表達情況比較

治療前，兩組TRAF6、NF-κB 表達情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組TRAF6、NF-κB 表達情況均較治療前降低，且治療組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 兩組治療前后結(jié)腸黏膜TRAF6、NF-κB 表達情況比較（OD，）

表6 兩組治療前后結(jié)腸黏膜TRAF6、NF-κB 表達情況比較（OD，）

注 TRAF：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子；NF-κB：核因子-κB

2.6 兩組治療前后免疫熒光TLR4 表達情況比較

治療前，兩組免疫熒光TLR4 表達情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組免疫熒光TLR4表達情況較治療前降低，且治療組低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1～2。

圖1 兩組治療前后免疫熒光Toll 樣受體表達情況（n=30）

圖2 兩例患者治療前后TLR4 免疫熒光表達（免疫熒光，200×）

3 討論

目前UC 的患者已遍布全球各地，且發(fā)病率快速上升。在目前國內(nèi)醫(yī)療資源及社保基金如此緊缺的形勢下，UC 將愈發(fā)成為我國社會的一大醫(yī)療負擔(dān)。

TLR4/TRAF6/NF-κB 通路是UC 致病過程中關(guān)鍵因素。外來致病因素對機體產(chǎn)生侵襲時，機體首先啟動固有免疫，TLR4 的表達被激活，而獲得性免疫應(yīng)答可被活化的TLR4 啟動，刺激TRAF6，憑借TRAF6依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB。UC 患者腸黏膜受損，腸道中大量的致病菌群可直接接觸腸上皮細胞，同時TLR4 陽性的巨噬細胞在受損的腸黏膜聚集，從而觸發(fā)TLR4/TRAF6/NF-κB 信號通路，導(dǎo)致NF-κB 的磷酸化，引起免疫系統(tǒng)的失衡與紊亂而致病[14-15]。而這些細胞因子又可以反過來激活NF-κB，形成惡性循環(huán)，加劇UC 的炎癥損傷[16-18]。因此阻斷TLR4/TRAF6/NF-κB 這一信號通路，將減弱UC 的炎癥反應(yīng)，起到治療作用。

在歷代中醫(yī)人的不懈努力下，中醫(yī)藥治療UC 的臨床療效在國內(nèi)已得到廣泛認可[19-20]。中醫(yī)學(xué)認為，UC 病位在大腸，與脾、肝、腎、肺諸臟功能失調(diào)有關(guān)[13,21-22]，其致病因素有濕熱、瘀毒、痰濁、氣滯、血瘀等，而活動期總離不開濕熱、瘀血。國醫(yī)大師徐景藩教授認為，UC 發(fā)病關(guān)鍵為“脾虛濕熱夾瘀，寒熱錯雜，肝、脾、腎同病”[23-24]。沈洪教授在此基礎(chǔ)上主張UC 活動期為氣血瘀熱搏結(jié)，血敗肉腐，內(nèi)潰成瘍[25]。廣東省名中醫(yī)勞紹賢教授亦提出，活動期UC 為血瘀化熱而成潰瘍[26]。張聲生教授也認為UC 病變過程中始終貫穿寒熱錯雜、氣血凝滯[27]?？梢姡琔C 活動期以標實為主，病理因素主要為濕熱、血瘀。本研究參考以上名醫(yī)的學(xué)術(shù)觀點，結(jié)合臨床經(jīng)驗，提出從濕熱、血瘀論治，制定驗方清腸湯，方以白頭翁湯化裁，共奏清熱化濕、活血化瘀、涼血止血之功。

本研究結(jié)果顯示，清腸湯能有效改善患者的相關(guān)臨床癥狀，降低Mayo 評分，抑制腸道的炎癥活動，同時還能促進結(jié)腸黏膜愈合，對改善患者的長期預(yù)后有重要意義。清腸湯聯(lián)合美沙拉嗪能弱化TLR4 免疫熒光表達，降低TRAF6 和NF-κB 免疫組織化學(xué)的表達水平，且較單獨使用美沙拉嗪更為有效，說明清腸湯能通過干預(yù)TLR4/TRAF6/NF-κB 信號通路，糾正UC患者的免疫系統(tǒng)失衡，促進結(jié)腸黏膜修復(fù)，這可能是其發(fā)揮抗炎作用的機制之一。