田繼云 杜晟楠 高靜靜 袁乙富 曹 勤 蔣元燁

上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200062

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是在無酒精和其他明確肝損傷因素的前提下，病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度積累所導(dǎo)致的一類慢性肝病，是一種與環(huán)境和遺傳因素密切相關(guān)的代謝類疾病[1]?！岸未驌簟奔僬f中[2]，肝細(xì)胞中甘油三酯和膽固醇酯的過多累積會導(dǎo)致線粒體功能損傷，同時(shí)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，分泌炎癥因子、炎癥細(xì)胞浸潤，從而引發(fā)肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、壞死，甚至肝纖維化，損傷肝功能，使單純性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）向非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）發(fā)展，最終導(dǎo)致肝纖維化甚至肝癌[3]。此外，NAFLD 與2 型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病也有著密切的關(guān)系[4-5]，對人類健康的危害巨大。但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，脂質(zhì)組學(xué)是基于LC-MS、GC-MS 等高通量的分析技術(shù)，對機(jī)體不同狀態(tài)下的脂質(zhì)水平進(jìn)行測定，并對其整體脂質(zhì)成分及與其存在相互作用的分子和基因的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)性分析，通過脂質(zhì)代謝及其代謝調(diào)控的比較，進(jìn)而揭示脂質(zhì)代謝與機(jī)體生理、病理過程之間關(guān)系的一門學(xué)科[6-7]。自2003 年脂質(zhì)組學(xué)這一概念被提出以后，給NAFLD 的發(fā)展機(jī)制提供了新的解讀思路[8]，本研究采用UPLC-Q-Orbitrap/MS 分析了NAFLD 患者和正常人群血清脂質(zhì)組學(xué)狀況，篩選表征NAFLD 的生物標(biāo)志物，并對NAFLD 患者脂質(zhì)代謝的特點(diǎn)進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年1 月至2021 年1 月上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院（以下簡稱“我院”）消化內(nèi)科診斷為NAFLD的患者30 例為NAFLD 組，另選擇同期我院30 名體檢確定為身體健康的志愿者作為對照組。記錄并統(tǒng)計(jì)受試者身高、體重、體重指數(shù)、肝功能、腎功能、血脂代謝等臨床數(shù)據(jù)。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會審批（PTEC-R-2020-29-1），受試者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《非酒精性脂肪性肝病中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017 年）》[9]規(guī)定的NAFLD 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，明確NAFLD 診斷需符合以下三項(xiàng)：①無飲酒史或折合成乙醇量，男性＜210 g/周、女性＜70 g/周；②除病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營養(yǎng)、肝豆?fàn)詈俗冃?、自身免疫性肝病等外可?dǎo)致脂肪肝的特定疾病。③肝活檢組織學(xué)改變符合脂肪性肝病的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。鑒于肝組織學(xué)診斷難以獲得，NAFLD 定義為：①肝臟影像學(xué)表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)且無其他原因可供解釋；②有代謝綜合征相關(guān)表現(xiàn)的患者出現(xiàn)不明原因的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和/或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶持續(xù)升高半年以上。減肥和改善胰島素抵抗（insulin resistance，IR）后，異常酶譜和影像學(xué)脂肪肝改善甚至恢復(fù)正常者可明確NAFLD 的診斷。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡16～75 歲，性別不限；②符合NAFLD 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；③各項(xiàng)資料信息、生化及標(biāo)本采集信息完整可靠；④簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并肝外纖維化疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕類疾病、腎功能衰竭、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、高血壓病、冠心病等；②合并心腦血管、泌尿系統(tǒng)、腎臟、造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病，惡性腫瘤、其他嚴(yán)重合并癥或精神??；③合并甲狀腺疾病，包括甲亢、甲減、亞臨床甲減、橋本甲狀腺炎。

1.5 儀器與試劑

超高效液相色譜（Ultimate 3000，Thermo）；高分辨質(zhì)譜（Orbitrap Elite，Thermo）；冷凍高速離心機(jī)（1730R，德國GENE 有限公司）；純水儀（Milli-Q，上海默瑞生物科技有限公司）；多管渦旋振蕩器（VX-Ⅱ，北京踏錦科技有限公司）；甲醇（質(zhì)譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：O0621152）；甲基叔丁基醚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20210227）；甲酸（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號：D1290265）；乙酸銨（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號：BCBR1129V）；異丙醇（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號：V589K144）；乙腈（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號：K3021728）。

1.6 血清樣本前處理

分別取兩組晨間空腹靜脈血10 ml，在4℃環(huán)境中靜置2 h 后1000 g 離心15 min（離心半徑為7 cm），取上清液，用于臨床血清生化及血脂檢測，剩余血清樣本分裝后于-80℃冰箱凍存。取分裝后的血清60 μl，分別加入1000 μl 甲基叔丁基醚、300 μl 甲醇和290 μl純水，振蕩混勻1 min 后，于1000 g、4℃條件下離心10 min，取上層溶液置于新離心管中冷凍干燥，待干燥后加入100 μl 復(fù)溶液（異丙醇∶甲醇為1∶1），振蕩1 min 后，再以10 000 g、4℃條件離心10 min，取上清液80 μl 轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶待測。

1.7 檢測條件

1.7.1 色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）液相色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈∶水（6∶4，V/V）+乙酸銨（10 mmol/L）+0.1%甲酸，B：乙腈∶異丙醇（1∶1，V/V）+乙酸銨（10 mmol/L）+0.1%甲酸；流速0.3 ml/min；進(jìn)樣量2 μl；柱溫45℃。流動(dòng)相梯度洗脫程序：0 min，30%B；0～2.0 min，30%→43%B；2.0～2.1 min，43%→55%B；2.1～12.0 min，55%→65%B；12.0～18.0 min，65→85%B；18.0～20.0 min，85%→100%B；20.0～25.0 min，100%B；25.0～25.1 min，100%→30%B；25.1～30.0 min，30%B。

1.7.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)量分析器為靜電場軌道離子阱。正負(fù)離子模式，以氮?dú)庾鳛榍蕷夂洼o助氣，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為50～1000。正離子模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 psi；輔助氣流速：5 L/min；尾氣流速：0.3 L/min；電噴霧電壓：3.0 kV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，30%。負(fù)離子模式：加熱器溫度300℃；鞘氣流速：45 psi；輔助氣流速：5 L/min；尾氣流速：0.3 L/min；電噴霧電壓：3.2 kV；毛細(xì)管溫度：350℃；S-Lens RF Level，60%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用LC-MS 軟件進(jìn)行峰對齊、保留時(shí)間校正及峰面積校正，采用LipidSearch 軟件鑒定脂質(zhì)代謝產(chǎn)物。使用主成分分析法（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。其他數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的采用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組一般資料及臨床生化指標(biāo)比較

NAFLD 組BMI、AKP、TP、CHE、尿素、TG 高于對照組（P <0.05）。兩組年齡、性別、TB、DB、ALB、γ-GT、ALT、AST、總膽汁酸、肌酐、尿酸、GFR、HDL-C、LDL-C、TC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料及臨床生化指標(biāo)比較

2.2 兩組PCA 結(jié)果

將兩組正負(fù)離子模式下采集的血清樣本數(shù)據(jù)分別進(jìn)行PCA 分析，得到PCA 圖。如圖1 所示，在兩種掃描模式下，兩組樣本得到較為完全的分離，提示NAFLD 患者發(fā)生代謝紊亂。正離子模式下R2X 和Q2為0.879 和0.798；負(fù)離子模式下R2X 和Q2為0.768 和0.854，提示模型良好。

圖1 兩組樣本PCA 圖

2.3 兩組OPLS-DA 結(jié)果

為了尋找可能的差異代謝物，進(jìn)一步行OPLSDA 分析。如圖2 所示，在兩種掃描模式下，兩組樣本完全分離。正離子模式下R2Y 和Q2為0.985 和0.937；負(fù)離子模式下R2Y 和Q2為0.913 和0.948，提示該模型擬合度和預(yù)判能力良好。

圖2 兩組樣本OPLS-DA 圖

2.4 兩組差異性脂質(zhì)生物標(biāo)志物結(jié)果

根據(jù)OPLS-DA 結(jié)果，篩選出VIP 值＞1 及P＜0.05 的脂質(zhì)類差異性代謝物181 個(gè)，包括甘油三酯（triglyceride，TG）、甘油二酯（diacylglycerol，DG）、單硬脂酸甘油酯（monoglyceride，MG）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、磷脂酰肌醇（phosphatidyl inositol，PI）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、O-?；?ω-羥基脂肪酸（O-acyl-ω-hydroxy fatty acids，OAHFA）、溶血磷脂酰肌醇（lysophosphatidyl inositol，LPI）、溶血磷脂酰甘油（lysophosphatidylglycerol，LPG）、溶血磷脂乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）及磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）等。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 兩組差異性脂質(zhì)生物標(biāo)志物結(jié)果

續(xù)表2

3 討論

肝臟是人體重要的代謝器官，與蛋白質(zhì)、糖類和脂類的合成代謝有密切的關(guān)系，主要參與內(nèi)源性脂肪的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。NAFLD 是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過多而引起的病變，已有研究證實(shí)，脂質(zhì)代謝紊亂是NAFLD的重要特征，NAFLD 患者肝臟及血清中TG、DG、游離脂肪酸、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、鞘脂及多種磷脂類成分與肝的DNL 過程、氧化應(yīng)激、線粒體和過氧化酶功能異常相關(guān)[12-14]，脂質(zhì)分子的種類和水平可能提示NAFLD 的病程和發(fā)展趨勢[15]。

Puri 等[16]對正常人、NAFL 及NASH 患者肝臟脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NAFL 及NASH 組較正常組TG、DG水平明顯升高，游離脂肪酸含量不變，TG/DG 值隨肝損傷的加重呈逐漸升高趨勢。Gorden 等[17]研究結(jié)果顯示，正常人及脂肪肝病變患者DG 存在顯著差異，表明DG 轉(zhuǎn)移酶在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，并認(rèn)為DG 的顯著增加是NAFLD 的標(biāo)志。同時(shí)，LPE 的含量與肝臟惡化程度呈負(fù)相關(guān)，NASH 患者LPE 水平較NAFL 患者更低。NAFL 及NASH 患者肝臟總PC水平低于正常人，認(rèn)為與DG 的合成增加有關(guān)。DG 參與NAFLD 時(shí)TG、PC、PE 等脂類水平的改變，可能是推動(dòng)NAFLD 發(fā)展的重要信號。Anjani 等[18]在肥胖NASH 婦女循環(huán)血液中也發(fā)現(xiàn)PC、PE、PI、PG、LPC水平升高，認(rèn)為在NAFLD 中肝臟及血清的甘油磷脂改變提示了疾病狀態(tài)下肝臟合成代謝及酶體的異常。

有研究推斷，血液中TG 增多時(shí)，脂肪酸的合成轉(zhuǎn)換增加，導(dǎo)致肝中乙酰輔酶A 積聚，繼而導(dǎo)致酰基膽堿等底物增加，誘導(dǎo)血清膽堿酯酶活性升高[19-20]。血清AKP 的含量增加可能是因?yàn)楦闻K上皮層受損及膽管內(nèi)壓力增高，導(dǎo)致AKP 大量進(jìn)入血清，提示了肝纖維化和肝硬化的病理進(jìn)程[21-22]。

鞘脂是構(gòu)成生物膜的重要組成部分，SM 可以被鞘磷脂酶水解，生成Cer 等代謝產(chǎn)物，可阻斷胰島素信號傳導(dǎo)，誘發(fā)IR 和炎癥反應(yīng)[23]。楊蕊旭等[24]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 組血清Cer 含量增加，而在慢性乙型肝炎患者中Cer 水平是降低的。Tu 等[25]也證實(shí)在NAFLD小鼠的肝臟及血漿中Cer 及SM 均增加。

由此可見，脂質(zhì)成分在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，多種脂類及其相關(guān)的酶參與和改變了NAFLD 的發(fā)展[26]，脂質(zhì)組學(xué)在NAFLD 的研究中起著重要的作用，深入探討脂質(zhì)代謝與NAFLD 的關(guān)系意義重大。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap/MS 對NAFLD患者和正常人群的血清進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者較正常人的脂質(zhì)代謝發(fā)生了顯著改變，鑒定的181 個(gè)脂質(zhì)生物標(biāo)志物包括甘油脂類、甘油磷脂、鞘脂類、脂肪酸等多種脂質(zhì)信號分子，或可作為潛在的NAFLD 的新靶標(biāo)。但是本研究仍然存在著局限，本研究結(jié)果雖已呈現(xiàn)了181 個(gè)潛在的脂質(zhì)生物標(biāo)志物，但仍缺乏后續(xù)更加深入的機(jī)制的探索，同時(shí)，本研究是單中心研究，患者來源較單一，是否有更進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值仍然值得深入探索。