吳輝淵

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

根據(jù)國(guó)家癌癥中心2022年2月統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，我國(guó)2016年新發(fā)肝癌38.9 萬例（約占總新發(fā)癌癥的9.6%），以肝癌為主要死因的病例數(shù)為33.6 萬例（約占癌癥總死亡數(shù)的13.9%），其發(fā)病率和死亡率在全部類別的惡性腫瘤中分別居第4 位與第2 位[1]。治療肝癌的主要手段包括外科手術(shù)、介入、靶向、免疫治療等，仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高、生存期短、不良反應(yīng)嚴(yán)重等問題[2～3]。中醫(yī)治療肝癌有獨(dú)特的療效和豐富的經(jīng)驗(yàn)[4～5]。肝積湯是醫(yī)院以柔肝、健脾、散結(jié)為治法的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究顯示肝積湯在中晚期肝癌患者的治療中取得了良好效果，能有效延緩肝癌進(jìn)展，改善患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，但具體分子機(jī)制未明[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用計(jì)算機(jī)生物分析軟件及數(shù)據(jù)庫，從分子水平上系統(tǒng)揭示中藥作用分子機(jī)制的方法[7]。其系統(tǒng)分析方法與中醫(yī)整體觀念下的辨證論治不謀而合。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法分析肝積湯治療肝癌的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 工具與方法

1.1 肝積湯活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 將肝積湯的組成藥物柴胡、茯苓、夏枯草、茵陳、豬苓、女貞子、旱蓮草、白術(shù)、半夏、白芍、青蒿、山楂作為關(guān)鍵詞輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%并且DL≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，選取中藥活性成分和靶點(diǎn)蛋白。利用Uniprot 對(duì)獲取的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，設(shè)置物種來源為“Human”，選擇“Reviewed”，得到與靶點(diǎn)蛋白相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因。

1.2 肝積湯治療肝癌的潛在靶點(diǎn)篩選 從GeneCards 數(shù)據(jù)庫以“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞檢索肝癌相關(guān)靶點(diǎn)。設(shè)定Relevance Score≥10。利用Venny2.1.0 對(duì)肝積湯活性成分靶點(diǎn)和肝癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集。得到肝積湯治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。

1.3 PPI 拓?fù)浞治?將1.2 得到的肝積湯治療肝癌的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置為“Homo sapiens”，并且highest confidence≥0.40，其他設(shè)置為String 系統(tǒng)默認(rèn)值，去除和其他蛋白無相互作用的蛋白，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)模型。結(jié)果以TSV 格式保存，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 分析作圖，獲得這些靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。利用Network Analyzer 進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過篩選Degree 前15 位基因?yàn)楹诵陌悬c(diǎn)。

1.4 GO 和KEGG 通路富集分析 基于R 軟件使用Bioconductor 生物信息軟件包以Pvalue＜0.05，Qvalue＜0.05 進(jìn)行GO 與KEGG 分析，以條形圖或氣泡圖的形式展示結(jié)果。

1.5 繪制“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 將有效活性成分、作用靶點(diǎn)與KEGG 信號(hào)通路之間的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件進(jìn)行可視化展示，形成“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer 計(jì)算Degree，藥物活性成分、靶點(diǎn)和KEGG 信號(hào)通路的Degree 越大越重要。

2 結(jié)果

2.1 肝積湯活性成分和靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件篩選肝積湯各成分，去除無預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的中藥成分，得到中藥成分有夏枯草11個(gè)、白術(shù)7個(gè)、柴胡17個(gè)、茵陳13個(gè)、豬苓11個(gè)、茯苓15個(gè)、女貞子13個(gè)、旱蓮草10個(gè)、半夏13個(gè)、白芍13個(gè)、青蒿22個(gè)、山楂6個(gè)。將得到的中藥成分合并去重，最終得到80個(gè)化合物和249個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 肝積湯治療肝癌的潛在靶點(diǎn) 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索得到肝癌相關(guān)靶點(diǎn)885個(gè)。將肝積湯活性成分對(duì)應(yīng)的249個(gè)靶點(diǎn)和肝癌相關(guān)的885個(gè)靶點(diǎn)合并去重，得到95個(gè)肝積湯治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將95個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化展示。見圖2。拓?fù)鋮?shù)結(jié)果顯示：Degree 排前15 位的蛋白有TP53、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、蛋白激酶B1（AKT1）、MYC、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB 抑制劑α（NFKBIA）、過氧化物合酶2（PTGS2）、FOS、BCL2L1、胱天蛋白酶8（CASP8）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、趨化因子配體8（CXCL8）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8），所有這些靶點(diǎn)的Degree 均超過平均值，這些蛋白很可能是肝積湯治療肝癌的核心靶點(diǎn)。

圖2 肝積湯治療肝癌PPI 靶點(diǎn)圖

2.4 肝積湯治療肝癌潛在靶點(diǎn)GO 富集分析 將潛在靶點(diǎn)經(jīng)R 語言運(yùn)行后GO 分析選取細(xì)胞組分（CC）、生物學(xué)過程（BP）和分子功能（MF）。GO 結(jié)果顯示，潛在靶點(diǎn)基因共富集至2 215 條生物過程通路中，37 條CC 表達(dá)過程中，128個(gè)與分子功能相關(guān)的過程中。以基因數(shù)（Genecount）排序，并選前10 條進(jìn)行繪圖。結(jié)果顯示主要的BP 涉及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖反應(yīng)等；CC 主要涉及細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、蛋白絡(luò)氨酸激酶等；MF 主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。見圖3。

圖3 GO 富集分析

2.5 肝積湯治療肝癌的KEGG 通路分析 利用R語言運(yùn)行潛在靶點(diǎn)，得到KEGG 通路159 條，以氣泡圖的形式展示前20 的結(jié)果，Pvalue 代表富集的顯著性，以顏色表示顯著性的高低，越紅顯著性越高。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與肝癌相關(guān)的通路上有顯著富集，如磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路、乙型肝炎病毒信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒（CMV）感染等信號(hào)通路。見圖4。

圖4 KEGG 通路分析

2.6 構(gòu)建 “成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)” 并分析 利用Cytoscape3.8.2 軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)使用Network Analyzer 功能進(jìn)行分析。將KEGG 富集分析結(jié)果中排名前二十的通路及相關(guān)成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，繪制出“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖5。圖中圓形代表通路，方形代表靶點(diǎn)，三角形代表成分，節(jié)點(diǎn)大小根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值大小變化。圖中共165個(gè)節(jié)點(diǎn)，851 條邊，其中66個(gè)成分節(jié)點(diǎn)，20個(gè)通路節(jié)點(diǎn)，79個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)。其中槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山柰酚（Kaempferol）Degree 值排名中藥成分前三，Degree 值分別為58、35、21。這3個(gè)成分涉及的靶點(diǎn)數(shù)目最多，很可能是肝積湯治療肝癌的主要活性物質(zhì)，分別來自夏枯草、女貞子、柴胡、青蒿、墨旱蓮、山楂、白芍、茵陳。見圖6。這些成分同時(shí)又通過TP53、VEGFA、AKT1 等多個(gè)靶點(diǎn)，共同作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎病毒信號(hào)通路、CMV 感染信號(hào)通路等多條信號(hào)通路。

圖5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 活性成分與中藥網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，本研究探索了肝積湯治療肝癌患者可能的活性成分、靶點(diǎn)和通路。通過“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖顯示，Degree 值排名靠前的中藥活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，這些成分可能是肝積湯治療肝癌的主要活性成分。槲皮素是廣泛存在自然界多種植物的黃酮類多酚物質(zhì)，有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[8]、抗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[9]、抗血管生成[10]及化療增敏作用[11]，木犀草素、山柰酚同樣有抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、抗血管生成及化療增敏作用[12～16]。

通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)可知，TP53、VEGFA、AKT1可能是肝積湯方作用于肝癌最為關(guān)鍵的靶點(diǎn)。TP53作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，大多數(shù)腫瘤發(fā)生了TP53基因突變，是目前常見的抑癌基因[17]。TP53 表達(dá)水平與肝癌患者總生存期相關(guān)，高表達(dá)患者預(yù)后差，無TP53 基因突變的肝癌患者預(yù)后好[18]。VEGFA 參與多種惡性腫瘤的侵襲、增殖和轉(zhuǎn)移過程，是目前最重要的促進(jìn)血管生成的因子[19]。肝癌中VEGFA 高表達(dá)患者的無進(jìn)展生存期、總生存期較VEGFA 低表達(dá)患者縮短[20]。中藥可下調(diào)VEGFA 的表達(dá)從而抑制血管生成[21]。

本研究KEGG 富集分析顯示，肝積湯治療肝癌主要涉及PI3K-Akt、乙型肝炎病毒、CMV 感染等信號(hào)通路。其中，PI3K-Akt 信號(hào)通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲，對(duì)肝癌的發(fā)病和進(jìn)展有著非常重要的作用，PI3K-Akt 信號(hào)通路受抑制后可以降低肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[22]，PI3K-Akt 信號(hào)通路也可以被槲皮素抑制從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[23]。木犀草素可以通過PI3K-Akt 通路抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。山柰酚抑制PI3K-Akt-ERK 等信號(hào)通路降低多種腫瘤的增殖和侵襲[25]。乙型肝炎病毒可以通過多個(gè)途徑導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[26]，在我國(guó)大部分原發(fā)性肝癌患者既往有慢性乙肝病毒感染史，通過抑制慢性乙肝病毒，阻斷肝細(xì)胞癌變，成為原發(fā)性肝癌臨床治療的重要方法。CMV 感染可能是肝癌的主要危險(xiǎn)因素，F(xiàn)aivre 等[27]發(fā)現(xiàn)CMV 血清陽性的肝癌患者更易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，CMV 感染與肝細(xì)胞癌死亡率有一定關(guān)聯(lián)。

本研究發(fā)現(xiàn)的槲皮素、木犀草素、山柰酚等作用于TP53、VEGFA、AKT1 等靶點(diǎn)，通過PI3K-Akt、乙型肝炎病毒等通路發(fā)揮治療肝癌的作用，與目前該領(lǐng)域研究得出的結(jié)果有一定的相似性[28]。槲皮素、山柰酚等存在于多種中藥特別是治療肝癌的中藥處方中，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用，目前研究較充分，從某種程度上也說明中藥治療肝癌在理論上的合理性和臨床上的有效性，同時(shí)也提示了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性。前期臨床研究證明肝積湯臨床療效確切，安全性好。本研究發(fā)現(xiàn)肝積湯的作用機(jī)理復(fù)雜，有多種活性物質(zhì)通過多個(gè)通路和靶點(diǎn)起效，這與中藥整體思路相符合。下一步將通過全面科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。