曾維軍，王晶，楊彝華，和耀威，劉瓊波，康超，楊玲

(1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550025；2.楚雄州林業(yè)與草原研究所，云南 楚雄 675005)

中國野生食用菌在國內(nèi)的市場占有率逐年增高，同時在國外市場上的需求也不斷上升，在整個國際市場上具有巨大的潛力，其中，印度塊菌是市場重要的貿(mào)易商品物種。印度塊菌(TuberindicumCooke et Massee)，屬于子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、盤菌目(Pezizales)、塊菌科(Tuberaceae)、塊菌屬(Tuber)[1]，主要分布于我國云南、四川，與松科(Pinaceae)、殼斗科(Fagaceae)等樹木共生[2]，其子囊果埋生于地下，直徑3～5 cm，球形至近球形，咖啡色、棕褐色至黑褐色[3]。從1988年我國發(fā)現(xiàn)印度塊菌以來，其形態(tài)特征、生態(tài)習(xí)性及產(chǎn)地分布、生長發(fā)育過程方面的研究取得顯著進步[4]。前人研究表明，印度塊菌的菌塘土壤主要為石灰?guī)r土，pH在6.0～6.8之間，土層疏松、干燥、透氣性好，有機質(zhì)含量高[4]。印度塊菌是典型的外生菌根真菌，外生菌根真菌與林木形成共生體，不僅是當?shù)鼐用袷杖氲闹匾M成部分，其菌絲體與林木根系密切連結(jié)起來，還能夠增強植物對氮、磷、水分以及礦質(zhì)元素的汲取能力，提高植物在干旱、高溫、病蟲害、鹽漬化、重金屬等逆境下的抵抗力，增強植物在脅迫中的耐受性。大多數(shù)樹木依靠菌根真菌(Mycorrhizalfungal)共生來獲得營養(yǎng)，印度塊菌的菌絲會選擇性地與樹木根系結(jié)合并穿透根系皮層進入皮層組織內(nèi)部，在細胞間隙中蔓延生長，產(chǎn)生專門的“吸器”與植物直接進行營養(yǎng)交換，土壤養(yǎng)分下降會使印度塊菌子囊果變小[5]。塊菌屬的發(fā)育過程可以簡單的分成3個階段：① 子囊孢子萌發(fā)形成菌絲；② 菌絲與宿主植物的根系形成外生菌根；③ 最終形成地下生的可食用的子囊果。塊菌的共生機制比較復(fù)雜，在生活史的不同階段皆受環(huán)境因素的影響，但塊菌與宿主植物間的根部及根際微生物之間的共生機制尚不清楚。塊菌菌根共生機制及子囊果形成和發(fā)育的分子機制是后基因組時代的2個重要的研究方向。印度塊菌子囊果為1 a生，每年10月開始進入成熟期，12月到次年1月，達到成熟的全盛時期[6]，進入成熟期后，其營養(yǎng)交換是否隨時間的改變呈規(guī)律性變化，菌塘土壤營養(yǎng)變化是否與其微生物多樣性改變有相關(guān)性，均未見相關(guān)研究報告。

因此，本研究以云南省楚雄州的野生印度塊菌的菌塘土壤為研究對象，通過原位土壤營養(yǎng)成分測定和基于Illumina Miseq平臺的高通量測序，從分析印度塊菌成熟期不同階段菌塘土壤營養(yǎng)變化規(guī)律和其真菌、細菌多樣性為切入點，探討互作關(guān)系，為揭示共生機制奠定基礎(chǔ)，進而為印度塊菌人工仿生態(tài)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及采樣點概況

試驗材料為云南省楚雄紫溪山(101.47°E、25.05°N)海拔1 896.52 m處的塊菌菌塘土壤，土壤類型為紅黃壤，塊菌子囊果由貴州省生物研究所鑒定為印度塊菌，共生樹種為云南松(Pinusyunnaensis)。從10月塊菌開始成熟到次年2月完全成熟，每月在預(yù)先確定已采集到子囊果的菌塘定位取土樣1次，每個菌塘5點取深度為5～20 cm的土壤，然后混合均勻，整個取土過程采取避免生物污染的措施?；旌贤寥婪殖?份，其中一份自然風干、碾磨、過篩后用于測定土壤營養(yǎng)指標，另一份-70 ℃冷藏，用于高通量測序，檢測均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 抽提和 PCR 擴增

1.2.2 Illumina Miseq 測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA) 進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer (Promega,USA) 對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific，美國)進行建庫:(1)接頭鏈接；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集；(4)磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE 300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2.3 土壤養(yǎng)分指標測定

分別按照國家林業(yè)局現(xiàn)行行業(yè)標準LY/T 1228—1999、LY/T 1232—1999、LY/T 1234—1999、LY/T 1233—1999、LY/T 1236—1999檢測土壤全氮、全磷、全鉀、有效磷、有效鉀含量[7-11]；分別按照國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部現(xiàn)行行業(yè)標準NY/T 1121.2—2006、NY/T 1121.6—2006測定土壤pH和有機質(zhì)含量[12-13]；按照現(xiàn)行地方標準DB51/T 1875—2014測定土壤堿解氮[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用方差分析確定處理之間的差異，使用鄧肯法進行多重比較。使用Uparse(version 7.0.1090)進行OTU分析，其中按最小樣本序列數(shù)進行樣本序列抽平。使用mothur ( version v.1.30.2)計算Alpha多樣性中的Chao1、Shannon指數(shù)，反映土壤中真菌、細菌群落的豐富度和多樣性?；跍y序數(shù)據(jù)，使用R語言工具作群落Bar圖。使用R語言vegan包中rda或者cca進行冗余分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤養(yǎng)分變化

由表1可知，塊菌成熟期菌塘土壤的各養(yǎng)分指標除了全鉀以外，其余均在次年1月達最大值，其中有效磷、全氮、堿解氮的變異系數(shù)較大，分別為88.46%、79.78%、75.38%，速效鉀變異系數(shù)最小，為46.53%。菌塘土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀的變化趨勢為先降后升，均在1月達最大值后降低，其中速效鉀含量較高，為295.15 mg/kg，有效磷含量較低，為22.68 mg/kg。菌塘土壤的pH呈遞增變化，由弱酸土變成弱堿土。

表1 土壤養(yǎng)分指標方差分析

2.2 菌塘土壤微生物多樣性與土壤營養(yǎng)相關(guān)分析

由表2可知，菌塘土壤的OTU沒有呈規(guī)律性變化，其中真菌的OTU最大值是在10月(546)和次年1月份(541)，兩者差異不顯著。細菌的OTU最大值是在次年2月份(1716)；真菌與細菌的Shannon指數(shù)變化趨勢為先減后增，其中2月份菌塘土壤細菌、真菌的Shannon指數(shù)最高，均值分別為4.24、3.58；12月的Shannon指數(shù)最低，均值分別為1.42、1.31；11月的菌塘土壤真菌和細菌的Chao1指數(shù)菌最低，均值分別為102.01、68.01；10月和次年1月的Chao1指數(shù)均較高，兩者差異不顯著；11月的Chao1指數(shù)顯著較低，均值分別為102.01、68.01。由圖1可知，土壤中真菌、細菌的Shannon指數(shù)與QAP的相關(guān)系數(shù)較大，分別為0.81、0.83，但相關(guān)性檢驗不顯著。

表2 不同海拔菌塘土壤微生物的豐富度和多樣性指數(shù)

圖1 土壤微生物多樣性與土壤理化特性的 Pearson相關(guān)矩陣

2.3 菌塘土壤真菌門和屬分類水平下群落組成分析

整個成熟期的塊菌菌塘土壤真菌共檢測出266 456個序列，其中10月到次年2月，每月采集的樣土對應(yīng)真菌序列數(shù)在41 477～57 378個之間，平均值為53 291個。由圖2a可知，塊菌成熟期內(nèi)菌塘土壤中真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，基因豐度為69.52%，顯著高于擔子菌門(Basidiomycota)和被孢霉門(Mortierellomycota)；菌塘土壤中真菌的優(yōu)勢菌屬為塊菌屬和被孢霉屬(Mortierella)，基因豐度分別為17.37%、13.82%，并且有10.24%的真菌不包含在現(xiàn)有的真菌屬分類體系中。

由圖2b可知，塊菌成熟期的菌塘土壤擔子菌門的基因豐度12月達到最高，變化范圍在48.94%～94.85%之間，變異系數(shù)為24.19%；塊菌屬的基因只有在12月和次年1月的菌塘土壤中檢測出，12月的基因豐度最高，為84.52%；土壤中被孢霉屬的基因豐度11月達到最高，變化范圍在2.41%～26.55%之間，變異系數(shù)為56.95%。

圖2 塊菌菌塘土壤真菌群落組成

2.4 菌塘土壤細菌門和屬分類水平下群落組成分析

整個成熟期的塊菌菌塘土壤細菌共檢測出152 108個序列，其中10月到次年2月。每月采集的樣土對應(yīng)細菌序列數(shù)在25 056～35 555個之間，平均值為30 422個。由圖3a可知，塊菌成熟期內(nèi)菌塘土壤中細菌的優(yōu)勢菌門分別是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，基因豐度分別為31.68%、24.73%、19.99%；菌塘土壤中細菌的優(yōu)勢菌屬為Vicinamibacteraceae菌群的細菌屬，豐度為9.11%，但未知屬的其他細菌豐度為41.28%。由圖3b可知，塊菌成熟期的菌塘土壤變形菌門的基因豐度呈明顯的遞減規(guī)律，豐度范圍在23.28%～36.09%之間，優(yōu)勢菌門中變形菌門的變異系數(shù)最小，為17.46%。由圖3c可知Vicinamibacteraceae菌群的細菌屬的基因豐度在次年2月達最高，為18.05%。

圖3 塊菌菌塘土壤細菌群落組成

2.5 菌塘土壤真菌和細菌門和屬分類水平下群落組成與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析

由圖4a、圖4b可知，塊菌成熟期菌塘土壤全磷、速效鉀、pH與塊菌屬Tuber微生物數(shù)量呈正相關(guān)，其中pH與塊菌屬微生物數(shù)量的正相關(guān)性最大，全氮、有機質(zhì)、有效磷、堿解氮與其呈負相關(guān)，其中同有機質(zhì)的負相關(guān)性最大，同時，塊菌作為優(yōu)勢真菌屬與菌塘土壤中其他豐度較高的屬(被孢霉屬Mortierella、Knufia屬、Saitozyma屬、青霉屬Penicillium)呈負相關(guān)，其中與Saitozyma屬的負相關(guān)性最大。由圖4c、圖4d可知，塊菌成熟期菌塘土壤除了pH與酸桿菌RB41呈負相關(guān)以外，其余土壤營養(yǎng)指標均與酸桿菌RB41呈正相關(guān)，其中速效鉀與其正相關(guān)性最大；塊菌成熟期內(nèi)菌塘土壤中慢生根瘤菌Bradyrhizobium與有機質(zhì)、全氮、堿解氮呈正相關(guān)，與有機質(zhì)的相關(guān)性較大；慢生根瘤菌與全鉀、pH呈負相關(guān)，與全鉀的相關(guān)性較大。

圖4 屬分類水平下塊菌菌塘土壤真菌、細菌群落組成與養(yǎng)分指標的RDA

2.6 菌塘土壤真菌和細菌屬分類水平下物種數(shù)目分析

由圖5可知，塊菌成熟期內(nèi)，其菌塘土壤真菌和細菌屬的數(shù)目為顯著正相關(guān)(P<0.05)，均呈先減后增的規(guī)律，成熟前期(11月)最少，成熟后期達到最大，物種數(shù)目變異系數(shù)分別為28.27%、7.79%。各月均沒有出現(xiàn)獨立新屬，真菌的共有屬類為11種，細菌的共有屬類為152種。

圖5 菌塘土壤真菌和細菌屬分類水平下物種Venn

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

自然條件下適宜黑孢塊菌生長的土壤 pH 值大于7.5，在匈牙利地區(qū)所分布的多個塊菌種類同樣是在偏堿性的土壤中生長[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)成熟期印度塊菌菌塘土壤的pH呈遞增變化，由弱酸變成弱堿，說明塊菌生長過程中能把土壤pH改變成利于自我生長的能力。清源等[17]研究發(fā)現(xiàn)，全氮含量在2.29～3.70 g/kg更有利于塊菌生長。本研究發(fā)現(xiàn)成熟期塊菌菌塘土壤全氮含量在0.25～4.36 g/kg，變異度較大，變異系數(shù)為75.91%，土壤有效磷含量與土壤中真菌、細菌多樣性的相關(guān)較強，相關(guān)系數(shù)為0.81。由此說明，土壤中的氮素營養(yǎng)對塊菌成熟期生長發(fā)育影響較大，磷素可能具有通過影響土壤真菌、細菌菌群從而調(diào)節(jié)塊菌生長發(fā)育的作用，作用機理有待進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟期內(nèi)菌塘土壤的真菌與細菌的多樣性指數(shù)——Shannon指數(shù)變化趨勢為先減后增，成熟中期(12月)較低，成熟后期(2月)較高。

本研究發(fā)現(xiàn)在屬分類水平下，塊菌成熟期內(nèi)的菌塘土壤真菌物種數(shù)和細菌物種數(shù)顯著正相關(guān)(P<0.05)，真菌的物種數(shù)目的變異系數(shù)大于細菌；塊菌菌塘土壤中真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，優(yōu)勢菌屬為塊菌屬和被孢霉屬，其中被孢霉屬與塊菌屬呈負相關(guān)，是競爭關(guān)系；細菌的優(yōu)勢菌門是變形菌門，其中慢生根瘤菌與酸桿菌RB41的基因豐度較高，為塊菌的主要土壤伴生細菌。酸桿菌RB41是土壤碳和添加到土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)的高效利用者[18-22]。其除與pH呈負相關(guān)外，同其余土壤營養(yǎng)指標均呈正相關(guān)，說明酸桿菌RB41的含量增加可以給菌塘土壤營養(yǎng)帶來增效作用從而促進成熟期塊菌的生長發(fā)育。同時發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌含量與土壤有機質(zhì)、全氮、堿解氮含量呈正相關(guān)，驗證了慢生根瘤菌的固氮作用[23-24]，其對菌塘土壤營養(yǎng)有增效作用，有利于成熟期塊菌的生長發(fā)育。成熟期內(nèi)菌塘土壤全磷、速效鉀、pH與塊菌屬數(shù)量呈正相關(guān)，理論上補充土壤磷、鉀含量，調(diào)節(jié)pH為弱堿性利于塊菌生長，作用機理需在后續(xù)仿生栽培試驗中進一步驗證。

3.2 結(jié)論

在塊菌成熟期，通過對菌塘土壤營養(yǎng)成分和真菌、細菌多樣性的原位監(jiān)測可得，成熟期塊菌菌塘土壤的真菌、細菌多樣性先降后升，次年2月達到最高，表明塊菌對其他真菌、細菌有抑制作用，且與土壤中的有效磷有較高的相關(guān)性；菌塘土壤中真菌的物種數(shù)目變異系數(shù)大于細菌，真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門，優(yōu)勢菌屬為塊菌屬和被孢霉屬，兩者是競爭關(guān)系，其中塊菌屬與全磷、速效鉀、pH呈正相關(guān)；細菌的優(yōu)勢菌門是變形菌門，基因豐度前五的酸桿菌RB41除與pH負相關(guān)以外，同其余土壤營養(yǎng)指標正相關(guān)，慢生根瘤菌含量與有機質(zhì)、全氮、堿解氮含量正相關(guān)。所以，在塊菌成熟期為了更好促進其生長，仿生栽培中理論可以補充土壤磷、鉀含量，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，加強酸桿菌RB41和慢生根瘤菌在土壤菌群中的優(yōu)勢，但其增效程度有待進一步驗證。