郝豆豆，張勇群，施靜，拉多，雷鳴

(1.西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川 成都 610041；2.西藏大學(xué)，西藏 拉薩 850001；3.青藏高原生物研究所，西藏 拉薩 850012)

青藏高原擁有高寒干旱、強(qiáng)輻射、低分壓的環(huán)境現(xiàn)狀，生活在青藏高原的生物面臨著來(lái)自其惡劣環(huán)境的各種壓力[1]。氣候、地貌、生物間的相互作用等因素決定了適宜物種分布的地理范圍[2]，青藏高原作為獨(dú)特的地質(zhì)-地理-生態(tài)單元，擁有獨(dú)特的生物資源，成為了世界生物多樣性研究的熱點(diǎn)地區(qū)。報(bào)春花科(Primulaceae)植物在我國(guó)高原廣泛分布，它與龍膽科(Gentianaceae)、杜鵑花科(Ericaceae)一起被稱為高山三大植物類群。該科植物種類繁多，對(duì)于維持高寒生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用[3]，且很多種植物在藏藥中具有較高藥用價(jià)值[4]。報(bào)春花屬(Primula)植物花色艷麗，富含黃酮類化合物，這些化合物有益于人體健康，是醫(yī)藥和化妝品行業(yè)的重要資源[5]。點(diǎn)地梅屬(Androsace)是極端環(huán)境生境中的高山墊層植物，能夠促進(jìn)其他植物物種生長(zhǎng)，改善土壤微生物群落，并增加植物、節(jié)肢動(dòng)物和微生物的豐度和多樣性[6]。白粉圓葉報(bào)春(Primulalittledalei)、柔小粉報(bào)春(P.pumilio)和禾葉點(diǎn)地梅(Androsacegraminifolia)是高海拔陸生多年生草本植物，其植株矮小、花色艷麗，大多分布在青藏高原海拔3 800～5 300 m的巖石縫隙中、草甸、碎石坡地，具有較高的觀賞價(jià)值，在藏醫(yī)藥中全草及花可以入藥[4]。

由于青藏高原惡劣的環(huán)境和復(fù)雜的古歷史氣候，近年來(lái)在生物如何適應(yīng)高海拔環(huán)境和多樣性形成機(jī)制研究方面已成為熱點(diǎn)地區(qū)[7-8]。在相似的環(huán)境中，生物體經(jīng)過(guò)選擇壓力進(jìn)化出相似的適應(yīng)性機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)可以獲取生物體在某個(gè)時(shí)間的所有RNA信息，并提供了一種快速有效的方法來(lái)獲取大量的蛋白質(zhì)編碼基因，通過(guò)鑒定物種之間同源基因，可用于探索非模式生物適應(yīng)生存環(huán)境的分子遺傳機(jī)制[9-10]。

本研究使用Illumina的雙末端RNA測(cè)序(RNA-seq)對(duì)白粉圓葉報(bào)春、柔小粉報(bào)春和禾葉點(diǎn)地梅進(jìn)行全基因組表達(dá)研究，并且通過(guò)對(duì)3個(gè)物種的正選擇單拷貝基因的分析，初步探討調(diào)節(jié)這3個(gè)物種適應(yīng)高海拔環(huán)境的生物學(xué)途徑和分子機(jī)制，確定與高山環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的潛在候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2020年7月在中國(guó)西部的西藏自治區(qū)拉薩市奪底溝采集了白粉圓葉報(bào)春、柔小粉報(bào)春和禾葉點(diǎn)地梅的新鮮葉片，將150 mg的新鮮葉片剪碎，放入裝有RNALater溶液的2 mL凍存管，并于-80 ℃的低溫冰箱中保存，直到提取RNA。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion)提取高質(zhì)量的總RNA，使用TruSeq鏈?zhǔn)絤RNA LTSample Prep試劑盒生成測(cè)序文庫(kù)，使用Illumina HiSeq X Ten對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序工作是在oebiotech(中國(guó)上海)公司完成，原始測(cè)序數(shù)據(jù)已提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 序列組裝和功能注釋

3種植物的葉片轉(zhuǎn)錄組mRNA測(cè)序原始數(shù)據(jù)使用Trimmomatic程序處理[11]。去除長(zhǎng)度小于50 bp且含有ploy-N的片段，獲得cleanreads；使用Trinity程序[12]進(jìn)行從頭組裝，去除<200 bp的轉(zhuǎn)錄本。使用Diamond程序與NCBI非冗余(NR)、SwissProt、 eggNOG、Pfam、GO分類和真核完整基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)來(lái)注釋基因的功能，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋其潛在的代謝途徑[13-14]。

1.4 三個(gè)物種直系同源基因的鑒定和選擇壓力分析

使用OrthoMCL軟件[15]鑒定3個(gè)物種的編碼基因的同源基因簇(正交群orthogroups)，排除編碼長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的基因，然后篩選出一對(duì)一的單拷貝直系同源基因用于后續(xù)分析。使用KaKs_Calculator(http://code.google.com/p/kaks-calculator/wiki/KaKs_Calculatoref)軟件包[16]計(jì)算非同義突變率(Ka)，同義突變率(Ks)和Ka/Ks值。Ka/Ks值可用于確定是否有選擇壓力作用于蛋白質(zhì)編碼基因，如果Ka/Ks>1，則考慮為正選擇效應(yīng)，該基因稱為正選擇基因；如果Ka/Ks=1，則認(rèn)為存在中性選擇；如果Ka/Ks<1，則認(rèn)為該基因受到純化選擇/負(fù)選擇。 Ka/Ks值越大，序列中發(fā)生的非同義突變?cè)蕉?，這樣的基因是快速分化的基因，這對(duì)于物種的進(jìn)化非常重要；與此相反，當(dāng)Ka/Ks為0或接近于0時(shí)，在序列中主要發(fā)生同義突變，這些基因相對(duì)保守，并且它們可能在進(jìn)化中受到強(qiáng)大的選擇約束[17]。Fisher’s exact test用于驗(yàn)證每個(gè)直系同源物的Ka和Ks值，正選擇基因的Ka/Ks值必須大于1，P值<0.05[18]。最后對(duì)篩選出的正選擇基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，注釋基因功能和代謝途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及質(zhì)控結(jié)果

對(duì)白粉圓葉報(bào)春、柔小粉報(bào)春和禾葉點(diǎn)地梅3個(gè)物種的新鮮葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，總共獲得20.94 Gb的數(shù)據(jù)和145 269 464 clean reads，所有reads的GC含量平均值為45.16%，Q30為93.85%,見表1。

表1 報(bào)春花科3種植物測(cè)序數(shù)據(jù)概覽

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果符合后續(xù)組裝分析的要求。原始數(shù)據(jù)已提交到NCBI(SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)中，白粉圓葉報(bào)春、柔小粉報(bào)春和禾葉點(diǎn)地梅3個(gè)物種對(duì)應(yīng)生成的數(shù)據(jù)查詢ID分別為SRR9110566、SRR9110567和SRR9112929。

2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝和unigene功能注釋

從頭組裝質(zhì)控后的核酸片段，3個(gè)物種中一共得到了51 666個(gè)unigene。Unigene的平均長(zhǎng)度為920bp，ContigN50的長(zhǎng)度為1 158bp(N50 = 1 158bp)(表2)，說(shuō)明這3個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的序列組裝結(jié)果好，測(cè)序質(zhì)量高，滿足后續(xù)的分析要求。將3個(gè)物種的所有unigene比對(duì)到蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(包括NCBI非冗余(NR)、SwissProt、eggNOG、Pfam、GO分類和KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù))。據(jù)每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中成功比對(duì)注釋的基因數(shù)目和占比(表3)，NR數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的Unigenes的數(shù)量最多。3個(gè)物種分別從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)得到的編碼序列(CDS)數(shù)目分別為15 213、16 781和16 940 個(gè)(表4)。在數(shù)據(jù)庫(kù)中未注釋到的unigene數(shù)目分別為649、793和1 290個(gè)，所占百分比分別為4%、4.5%和7.1%整體的功能注釋成功率較高。

表2 3種植物轉(zhuǎn)錄組組裝信息匯總

表3 基于7個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋

表4 編碼序列數(shù)量的統(tǒng)計(jì)

2.3 正交群鑒定和正選擇分析

用OrthoMCL軟件分析鑒定3個(gè)物種編碼基因的同源基因簇(正交群)，3個(gè)物種共有的正交群(orthogroups)為7 030個(gè)，其中白粉圓葉報(bào)春(989個(gè))和柔小粉報(bào)春(679個(gè))特有的正交群數(shù)量相近，并且顯著少于禾葉點(diǎn)地梅(1 919個(gè))特有的正交群數(shù)量。這表明白粉圓葉報(bào)春和柔小粉報(bào)春的親緣關(guān)系更近(圖1) 。從3個(gè)物種共有的7 030個(gè)正交群中鑒定出2 151個(gè)包含單拷貝直系同源基因的正交群，將這些直系同源基因用于非同義(Ka)和同義(Ks)替換進(jìn)化分析，其中有827個(gè)單拷貝直系同源基因的 Ka/Ks(ω)大于1、Fisher testP<0.05，表明這些基因受到了正選擇作用；而且，其中有553個(gè)單拷貝直系同源基因的Ka/Ks(ω)大于1、Fisher testP<0.01。

圖1 3個(gè)物種共有和特有的同源基因簇

2.4 3個(gè)物種的正選擇單拷貝直系同源基因功能注釋

對(duì)827個(gè)受到正選擇的單拷貝直系同源基因進(jìn)行了GO富集分析，包括細(xì)胞成分(CC)，分子功能(MF)和生物過(guò)程(BP)(圖2)。

圖2 正選擇基因的GO功能注釋

三大功能的生物學(xué)過(guò)程中包含的基因數(shù)目最多，分子功能包含的最少。在不同的功能群中發(fā)現(xiàn)了一些基因表現(xiàn)出快速進(jìn)化模式，具有強(qiáng)選擇(Ka/Ks>1)的跡象，很可能與環(huán)境適應(yīng)和應(yīng)急反應(yīng)有關(guān)，因?yàn)槠渲写蠖鄶?shù)基因參與編碼植物代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的載體(GO0009921，GO0005458)或酶(GO1903600谷氨酰胺酶復(fù)合物，GO0000276 ATP酶合成復(fù)合物，GO0004076生物素合成酶，GO0033984、GO0050589花青素合成酶，GO0003998?；姿崦?，GO0003842脫氫酶)，還有很多受到正選的基因與遺傳信息的加工有關(guān)(GO:0001105，GO:0001158)。

KEGG富集分析結(jié)果包括四類：細(xì)胞過(guò)程(CP)，環(huán)境信息處理(EIP)，遺傳信息處理(GIP)，代謝(MB)(圖3)。共有684個(gè)正選擇基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中成功注釋，涉及23個(gè)代謝途徑。受到正選擇的單拷貝同源基因的功能主要富集在運(yùn)輸、分解代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(信號(hào)肽酶復(fù)合物亞基、信號(hào)肽酶復(fù)合物催化亞基SEC11、Sec依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)、遺傳信息加工(復(fù)制和修復(fù)、折疊、轉(zhuǎn)錄、翻譯)、能量代謝(核苷酸代謝、碳水化合物代謝、輔因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝)(圖4)。參與了嘌呤和嘧啶代謝的3個(gè)受到正選擇的基因——肌苷5’-單磷酸脫氫酶(guaB)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT1)和胞苷脫氨酶(cdd)——也參與了藥物代謝。同時(shí)，鑒定出8個(gè)受到正選的基因與過(guò)氧化物酶體代謝通路相關(guān)，包括過(guò)氧化物酶體膜蛋白輸入受體(PEX3、PEX19、PEX13、PEX14)，過(guò)氧化物酶體膜蛋白(MPV17)、對(duì)脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝的過(guò)氧化物酶體植酸酰輔酶A羥化酶(PHYH)和脂肪酰基輔酶A還原酶(FAR)、參與視黃醇代謝的脫氫酶/還原酶SDR家族成員4(DHRS4)，以及3種與類黃酮生物合成相關(guān)的酶——查爾酮異構(gòu)酶、黃酮醇合酶和花青素合酶。將富集到KEGG結(jié)果中的PSG基因的Ka/Ks值進(jìn)行排序，表5中展示了受到正選擇壓力最強(qiáng)的前30個(gè)基因。

圖3 正選擇基因的KEGG通路分類

圖4 正選擇基因在KEGG富集分析結(jié)果中的前20項(xiàng)注釋結(jié)果

表5 KEGG富集結(jié)果中根據(jù)Ka/Ks值排序后的前30個(gè)基因

續(xù)表5

3 討論與結(jié)論

在自然界中，植物會(huì)面臨很多的脅迫方式，例如鹽堿、重金屬、干旱、高溫、寒冷、強(qiáng)輻射等等，對(duì)其生存造成威脅[19]。在有害脅迫的刺激下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)脅迫機(jī)制，如：生物堿類、精氨酸和脯氨酸代謝在猴樟(Cinnamomumbodinieri)響應(yīng)鹽堿脅迫機(jī)制中起主要作用[20]；毛白楊(Populustomentosa)懸浮細(xì)胞受到氧化脅迫，抑制了磷酸酶活性導(dǎo)致線粒體功能異常，于激素相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響生長(zhǎng)發(fā)育[21]。通過(guò)直系同源基因的選擇壓力分析，可以獲得植物在脅迫環(huán)境下的受到不同選擇作用的基因表達(dá)模式[22]。

白粉圓葉報(bào)春、柔小粉報(bào)春和禾葉點(diǎn)地梅3個(gè)物種中很多受到正選擇作用的單拷貝直系同源基因與惡劣的高原環(huán)境有關(guān)，并參與了多種生物過(guò)程。其中28個(gè)受到正選擇的基因(positively selected genes,PSG)參與能量代謝(如碳水化合物、運(yùn)輸)，這對(duì)于3種植物應(yīng)對(duì)青藏高原上的寒冷的氣候至關(guān)重要。受到環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生氧化脅迫，因此，激素調(diào)節(jié)、抗氧化等相關(guān)通路被激活，從而使植物適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境[23]。過(guò)氧化物酶體的功能復(fù)雜，很多重要的代謝活動(dòng)都發(fā)生在過(guò)氧化物酶體中，例如活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的基礎(chǔ)代謝，以及脂質(zhì)代謝，激素生物合成、代謝的生理過(guò)程[24]。本研究鑒定出了8個(gè)受到正選擇的基因(SOD1、DECR2、MPV17、SOD2、MLYCD、PEX19、PXMP2、MPV17)參與過(guò)氧化物酶體反應(yīng)。過(guò)氧化物酶體具有很強(qiáng)的增殖能力，并能根據(jù)周圍的細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行生化適應(yīng)，從而幫助植物適應(yīng)環(huán)境變化。類黃酮參與植物對(duì)刺激的響應(yīng)，鑒定出3個(gè)受到正選擇的基因編碼與類黃酮生物合成相關(guān)的酶，黃酮類是植物的主要次生代謝物，是花青素生物合成和代謝的重要前體[25]，還具有抗氧化劑活性[26,28]，并提供針對(duì)生物(如昆蟲、食草動(dòng)物、病原體)和非生物脅迫(如紫外線輻射、多余光能的消散)的保護(hù)。

此外，受到正選擇的單拷貝同源基因(如RBMX、HNRNPG、SNRPF、SMFRP-L27、MRPL27、rpmA、RP-L11、MRPL11、rplK、RP-S29e、RPS29、RP-L36、MRPL36、rpmJ等)中有很多與遺傳信息的加工相關(guān)，如編碼RNA聚合酶蛋白成分(RPB4、RPB9、RPABC3、RPC11，RPA49)，參與RNA加工和修飾、mRNA剪接/加工因子CDC5/CEF1、38B和SPF27，在青藏高原各種惡劣環(huán)境因素造成的基因損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用；3個(gè)受到正選擇的基因(LHCA1，LHCA2和LHCB3)與光收集復(fù)合體(LHC)同源，構(gòu)成了光系統(tǒng)I(PSI)和PSII的天線系統(tǒng)[27]，這些正選擇基因可能在響應(yīng)強(qiáng)烈的太陽(yáng)輻射和青藏高原的長(zhǎng)時(shí)間日照方面發(fā)揮重要作用。

生長(zhǎng)素是通過(guò)控制細(xì)胞分裂和分化來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育，生長(zhǎng)素在組織內(nèi)的分布差異是通過(guò)極性生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)(PAT)機(jī)制介導(dǎo)的，PIN1樣生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因在受到了正選擇作用(Ka/Ks> 1、P=2.05E-07)，該基因在控制植株高度中扮演重要的角色，白粉圓葉報(bào)春、柔小粉報(bào)春和禾葉點(diǎn)地梅植株矮小，有利于抵抗青藏高原的各種環(huán)境脅迫(例如強(qiáng)紫外線、低溫、強(qiáng)風(fēng)、食草動(dòng)物等)。

綜上所述，這3種植物為了適應(yīng)復(fù)雜嚴(yán)酷的高海拔生境而進(jìn)化出共同的適應(yīng)機(jī)制——受到正選擇的單拷貝同源基因參與了碳水化合物運(yùn)輸和代謝、氨基酸代謝、氧化磷酸化、脂肪酸生物合成和代謝、嘌呤和嘧啶代謝、次生代謝(類黃酮生物合成)和遺傳信息加工及翻譯后修飾。這些生物過(guò)程對(duì)于這3個(gè)物種應(yīng)對(duì)青藏高原惡劣環(huán)境(紫外線輻射、氣溫低、強(qiáng)風(fēng)、貧瘠的土壤)至關(guān)重要。本研究從分子生物學(xué)層面揭示了植物對(duì)高海拔環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，為高山植物遺傳進(jìn)化的分子機(jī)制研究提供了思路。