秦建品，陳 明，許 詣，沈文婷

(湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽(yáng)市中心醫(yī)院兒科，湖北 襄陽(yáng) 441021)

癲癇是一類由腦組織內(nèi)神經(jīng)元高度同步化異常放電引起的綜合征，是兒科常見(jiàn)疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床以反復(fù)、短暫、發(fā)作性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為特征，患者多表現(xiàn)為意識(shí)喪失、四肢抽搐、精神及行為障礙等[1]。流行病學(xué)結(jié)果顯示，癲癇在一般人群中的發(fā)病率為0.4%～0.7%左右，以少兒居多[2]。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶基因的3′端非翻譯區(qū)匹配轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控，可抑制翻譯或降解mRNA來(lái)阻止蛋白表達(dá)；miRNA的失調(diào)可能導(dǎo)致神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病，包括癲癇[3]。早期研究發(fā)現(xiàn)，miR-219是一種腦特異性miRNA，通過(guò)調(diào)節(jié)CaMK2G/NMDA通路在抑制癲癇發(fā)作的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。有研究表明miR-219a-5p是鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ gamma，CaMK2G)的靶基因[5]，在神經(jīng)元的發(fā)育中起重要作用；而癲癇的發(fā)作與神經(jīng)元凋亡和腦損傷有關(guān)[6]，但其具體作用機(jī)制至今尚未闡明?；诖?，本研究通過(guò)檢測(cè)癲癇患兒血清中miR-219a-5p與CaMK2G的表達(dá)水平，探討二者的關(guān)系及臨床意義。

1資料和方法

1.1研究對(duì)象

選取2017年6月至2019年6月本院收治的46例癲癇患兒為研究組，均符合國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟于2016年制定的癲癇及癲癇綜合征分類診斷新方案[7]。同期選取與研究組性別、年齡相對(duì)應(yīng)的50例健康體檢兒童為對(duì)照組，排除既往癲癇發(fā)病史或家族癲癇發(fā)病史、合并感染性疾病、腦炎、腫瘤、自身免疫性疾病患兒。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NO.2017-0326)，入組兒童家屬或監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2樣本采集與檢測(cè)

研究組患兒在癲癇發(fā)作時(shí)取外周血5mL，對(duì)照組兒童取清晨空腹靜脈血5mL，3 000r/min離心15min，分別置于干凈EP管中，貼好標(biāo)簽，-20℃條件下保存。采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)血清中miR-219a-5p、CaMK2G水平進(jìn)行檢測(cè)。使用Trizol試劑盒從血清中提取總RNA，利用NanoDropND-1000分光光度儀(NanoDrop Tech，美國(guó))檢測(cè)RNA濃度。使用PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以上均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作步驟執(zhí)行。循環(huán)參數(shù)：95℃，預(yù)變性3min；90℃，變性5s；60℃，退火20s，共40個(gè)循環(huán)。miR-219a-5p以U6為內(nèi)參，CaMK2G以GAPDH為內(nèi)參。引物序列由生工生物工程公司合成(表1)。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-219a-5p的相對(duì)表達(dá)量及CaMK2G水平。

表1 引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組患兒一般資料的比較

研究組和對(duì)照組患兒在年齡、性別、身高、體重方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表2。

2.2兩組患兒血清miR-219a-5p、CaMK2G表達(dá)水平比較

研究組患兒血清中miR-219a-5p水平明顯高于對(duì)照組，CaMK2G水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別是5.314、3.855，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組患兒一般資料的比較

表3 研究組和對(duì)照組血清中miR-219a-5p、CaMK2G表達(dá)水平比較

2.3血清miR-219a-5p、CaMK2G水平對(duì)癲癇患兒的診斷價(jià)值

ROC分析結(jié)果顯示，血清miR-219a-5p、CaMK2G診斷癲癇患兒的曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.807(95%CI：0.714～0.881)、0.752(95%CI：0.653～0.834)，其靈敏度分別是69.57%、78.26%，特異度分別是80.00%、62.00%；血清miR-219a-5p、CaMK2G聯(lián)合預(yù)測(cè)癲癇患兒的AUC為0.860(95%CI：0.774～0.922)，靈敏度和特異度分別為97.83%、60.00%，詳見(jiàn)圖1和表4。

圖1 血清miR-219a-5p、CaMK2G水平斷癲癇患兒的ROC曲線

表4 血清miR-219a-5p、CaMK2G水平對(duì)癲癇患兒的診斷價(jià)值

2.4癲癇患兒血清miR-219a-5p、CaMK2G水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示(圖2)，癲癇患兒血清miR-219a-5p與CaMK2G水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.424，P<0.05)。由miRTarBase可知miR-219a-5p靶向CaMK2G表達(dá)的基因序列有3段，如圖3所示。

圖2 癲癇患兒血清miR-219a-5p、CaMK2G表達(dá)的相關(guān)性

圖3 miR-219a-5p靶向CaMK2G表達(dá)的基因序列

3討論

3.1探討癲癇發(fā)生相關(guān)指標(biāo)的重要性

癲癇是由腦組織神經(jīng)元異常放電引起腦功能異常的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病具有不可預(yù)知性，反復(fù)性發(fā)作可導(dǎo)致腦功能損傷；若未得到及時(shí)治療，可造成患兒智力障礙，不僅影響身心健康，還對(duì)今后的學(xué)習(xí)、生活造成嚴(yán)重?fù)p害。我國(guó)癲癇相關(guān)的流行病學(xué)研究顯示，華東和西南地區(qū)的癲癇患病率在0.5%左右，患病人數(shù)高達(dá)900萬(wàn)，首次發(fā)病多發(fā)生于兒童、青少年時(shí)期，男性多于女性，有顯著的遺傳傾向，基因突變和蛋白質(zhì)異常修飾在癲癇的發(fā)病中占主要原因[8]。

3.2 miRNA在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用

隨著生物基因技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠結(jié)合數(shù)百種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，參與生命過(guò)程中細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育及凋亡[9]。有研究表明，miRNA參與調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程，通過(guò)結(jié)合靶mRNA抑制蛋白質(zhì)合成或?qū)е耺RNA降解來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，臨床上可利用側(cè)腦室注射miRNAs激動(dòng)劑治療腦損傷[10]。廖蕓茜等人將出生2天的Sprague-Dawley大鼠用脂多糖模擬早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷，通過(guò)側(cè)腦室注射miR-219激動(dòng)劑提高miR-219在大鼠腦組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可有效抑制SOX6蛋白表達(dá)，提高成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物MBP表達(dá)，從而改善全身炎癥導(dǎo)致的新生大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟障礙[11]。

3.3血清miR-219a-5p和CaMK2G水平在癲癇患兒中的表達(dá)及診斷價(jià)值

少突膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生可使血腦屏障的完整性和細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境電解質(zhì)的平衡遭到破壞，導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度異常放電，從而引起癲癇的發(fā)生、發(fā)展[12]。miR-219是少突膠質(zhì)細(xì)胞特有的miRNA，是促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的必需物質(zhì)，能改善由總miRNA缺失導(dǎo)致的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化發(fā)育缺陷。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-219在癲癇患者杏仁核中低表達(dá)，可能在癲癇患者的興奮性神經(jīng)傳遞中發(fā)揮調(diào)控作用，為耐藥癲癇的miRNA生物學(xué)開(kāi)辟了新的途徑[13]。Wang等人將miR-219模擬物轉(zhuǎn)染大鼠海馬神經(jīng)元，觀察miR-219對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元神經(jīng)毒性的保護(hù)作用，熒光素酶報(bào)告基因確認(rèn)CaMK2G是miR-219的靶基因，經(jīng)谷氨酸刺激后miR-219表達(dá)下降、CaMK2G表達(dá)上升，說(shuō)明miR-219通過(guò)負(fù)調(diào)控CaMK2G表達(dá)而減輕谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)源毒性[14]。CAMK2G表達(dá)降低可能嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)元的遷移和成熟[15]。有報(bào)道稱，可在小鼠海馬神經(jīng)元損傷模型中檢測(cè)到miR-219a-5p差異性表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，癲癇患兒血清中miR-219a-5p表達(dá)上調(diào)而CaMKII2G表達(dá)下調(diào)；Pearson相關(guān)分析顯示癲癇患兒血清miR-219a-5p與CaMK2G水平呈負(fù)相關(guān)，上述結(jié)果均提示miR-219a-5p可能靶向負(fù)調(diào)控CaMK2G表達(dá)，與癲癇的發(fā)病、發(fā)展有關(guān)。ROC分析顯示，血清miR-219a-5p和CaMK2G對(duì)癲癇患兒均有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，且二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)預(yù)測(cè)價(jià)值最大。

綜上所述，癲癇患兒血清miR-219a-5p表達(dá)上調(diào)，CaMK2G表達(dá)下調(diào)，miR-219a-5p可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控CaMK2G表達(dá)參與癲癇的發(fā)生發(fā)展，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。