黃 琳 李 彬 胡作為△

武漢市第一醫(yī)院1腫瘤科，2甲乳外科，武漢 430022

肺癌是中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，放射治療是臨床上治療肺癌的主要手段，無論是在新輔助治療、術(shù)后輔助治療以及晚期姑息治療階段，放射治療發(fā)揮著重要的作用；其主要是通過電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA損傷，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[1]。隨著放射物理學(xué)的飛速發(fā)展，從二維放療發(fā)展到目前的三維適形放療和調(diào)強(qiáng)放療，肺癌放療療效明顯提高。但是由于周圍正常組織尤其是心臟、肺組織、脊髓等對放療劑量的限制，腫瘤的異質(zhì)性以及某些肺癌細(xì)胞存在放射抵抗性，限制了肺癌放射治療的效果。因此，積極探索肺癌的放射敏感性機(jī)制，尋找肺癌的放射增敏藥物具有重要意義。人參皂苷Rg3是存在于人參中的一種微量四環(huán)三萜皂甙，藥理學(xué)研究[2-3]表明，人參皂苷具有選擇性抑制腫瘤細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。還有研究[4]表明，人參皂苷Rg3可以通過下調(diào)PD-L1的表達(dá)來提高放射敏感性和免疫功能。近年來，以長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)為代表的腫瘤表觀遺傳學(xué)研究取得了革命性進(jìn)展，LncRNA被認(rèn)為可以影響包括增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)、代謝、細(xì)胞周期和放射敏感性在內(nèi)的幾乎所有腫瘤生物學(xué)特征[5]。LncRNA PXN-AS1是近幾年剛發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，已經(jīng)有研究[6]表明，PXN-AS1可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌的化療抵抗，并被發(fā)現(xiàn)是胰腺癌的抑癌基因，但其在肺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過選擇肺癌細(xì)胞株，探究人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞放射敏感性的影響及調(diào)控LncRNA PXN-AS1表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞及藥物

肺癌細(xì)胞株(A549、H466、H1299、H522)購自中科院上海細(xì)胞研究所。人參皂苷Rg3購自南京春秋生物工程有限公司，純度95%，CAS號14197-60-5，用二甲基亞砜(DMSO)助溶后再將人參皂苷Rg3用細(xì)胞培養(yǎng)液(RPMI1640)稀釋到1×10-6mol/L，于-20 ℃凍存。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司；引物由華大基因合成；Trizol總RNA提取試劑購自北京TIANGEN公司；胎牛血清購自上海BI公司；八肽膽囊收縮素(CCK-8)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。干燥箱、培養(yǎng)箱購自上海潤度生物科技有限公司；離心機(jī)、多孔培養(yǎng)板、移液器購自上海菌淼分離技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀、酶標(biāo)儀購自上海同進(jìn)基因科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中含10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗)，培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、含5% CO2。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，用胰酶消化后選取2 mL細(xì)胞懸液并接種到6孔板中(保持細(xì)胞密度為1×105個/mL)用于下一步實驗。

1.4 CCK8實驗

對于CCK8分析，在100 mL的DMEM中，每孔2×103個細(xì)胞接種到96孔板中。在指定的時間點，采用CCK-8試劑盒在OD 450 nm處繪制增殖曲線。

1.5 克隆形成實驗觀察人參皂苷Rg3的放射增敏作用

取對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞(A549、H1299)制備成單細(xì)胞懸液，分為研究組和對照組。研究組用人參皂苷Rg3處理(濃度為10 mmol/L)，將2種細(xì)胞消化，0及2 Gy種2500、4及6 Gy種3000、8及10 Gy種4000個細(xì)胞/培養(yǎng)皿中，24 h后細(xì)胞貼壁，予以X射線照射0、2、4、6、8、10 Gy，劑量率為2 Gy/min，每個劑量組設(shè)3個平行樣，培養(yǎng)14 d后，棄去培養(yǎng)基、PBS沖洗、甲醛固定、Giemsa染色30 min、PBS沖洗后晾干，顯微鏡下計數(shù)含50個細(xì)胞以上的細(xì)胞集落。貼壁率(plating efficiency，PE)=(對照組集落數(shù)/細(xì)胞種植數(shù))×100%；存活率(surviving fraction，SF)=實驗組集落數(shù)/(細(xì)胞種植數(shù)×貼壁率)。實驗結(jié)果采取多靶單擊模型擬合數(shù)據(jù)并繪制克隆形成曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

選取腫瘤細(xì)胞并培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用PBS清洗后均勻地混合A549、H1299細(xì)胞與500 μL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液和5 μL Annexin-V-FITC，避光放置15 min，上機(jī)前5 min加入2.5 μL PI溶液進(jìn)行染色，均勻混合后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。所有操作依照Annexin V-FITC/PI試劑說明書進(jìn)行。

1.7 熒光定量PCR檢測PXN-AS1的表達(dá)

采用Trizol試劑提取肺癌細(xì)胞總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。熒光定量PCR檢測方法以U6和GAPDH作為內(nèi)參照，按熒光定量試劑盒說明書建立PCR反應(yīng)體系(包括2 μL cDNA、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物)。PCR運行參數(shù)設(shè)置為95 ℃ 3 min，然后進(jìn)行下列反應(yīng)：92 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，一共進(jìn)行35個循環(huán)。PCR檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行匯總分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞具有放射增敏作用

采用克隆形成實驗驗證人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞A549以及H1299的放射增敏作用。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3能夠明顯降低肺癌細(xì)胞的克隆形成率(P<0.05)。見圖1。

圖1 人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞克隆形成率的影響

2.2 人參皂苷Rg3可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡

流式凋亡檢測的結(jié)果顯示，相比對照組，研究組加用了人參皂苷Rg3后，肺癌細(xì)胞A549以及H1299的細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。見圖2。

圖2 人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 PXN-AS1在肺癌中的表達(dá)及臨床意義

熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，相比正常對照組織，PXN-AS1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖3A。

對4種肺癌細(xì)胞中PXN-AS1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，PXN-AS1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)均明顯高于正常細(xì)胞(P<0.05)。見圖3B。

利用生信數(shù)據(jù)庫查詢得到，高表達(dá)PXN-AS1的患者，其預(yù)后要明顯差于PXN-AS1低表達(dá)的患者(P<0.05)。見圖3C。

圖3 PXN-AS1在肺癌中的表達(dá)

2.4 人參皂苷Rg3可以下調(diào)PXN-AS1的表達(dá)

加入人參皂苷Rg3后，利用熒光定量PCR對PXN-AS1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，研究組PXN-AS1的表達(dá)均發(fā)生了明顯下調(diào)(P<0.05)。見圖4。

圖4 2組細(xì)胞PXN-AS1水平比較

3 討論

在我國肺癌發(fā)病率和死亡率均占據(jù)所有惡性腫瘤的首位[7]，放射治療是貫穿肺癌患者各個階段的重要治療手段。然而，放射治療通常受到周圍正常組織的劑量限制以及肺癌細(xì)胞對放射治療的抵抗性等多種因素影響，從而導(dǎo)致治療效果降低。臨床常用的放射增敏劑有同步化療增敏、抗血管靶向治療增敏、免疫檢測點抑制劑增敏等，但大多價格昂貴或副反應(yīng)較大。中藥的抗腫瘤作用日益被大家所關(guān)注，有研究表明，姜黃素可以調(diào)高鼻咽癌的放射治療效果[8]，姜黃素可以通過減少DNA損傷的修復(fù)來提高直腸癌的放射敏感性[9]。因此，積極尋找可以提高肺癌細(xì)胞放射敏感性的中草藥，對于提高肺癌的放射治療效果具有重要的臨床意義。

人參皂苷Rg3是從中藥材人參中分離出來的四環(huán)三萜皂苷，有抗腫瘤的作用[10]。人參皂苷Rg3通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移、抑制血管內(nèi)皮生長因子活性及其信號傳導(dǎo)來發(fā)揮抗腫瘤作用，此外還具有抑制血管外基質(zhì)降解等抑制腫瘤血管生成的作用[11]。本研究進(jìn)行克隆形成實驗，結(jié)果顯示人參皂苷Rg3能夠明顯降低肺癌細(xì)胞的克隆形成率，驗證了人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞的放射增敏作用。細(xì)胞凋亡和DNA損傷修復(fù)是影響放射敏感性的重要因素，表型研究也表明，相比對照組，加用了人參皂苷Rg3后，肺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率和DNA損傷明顯增加，結(jié)果顯示人參皂苷Rg3可以增加肺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和DNA損傷，這一結(jié)果與人參皂苷Rg3具有放射增敏作用的結(jié)果相一致。研究結(jié)果提示，人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞具有放療增敏作用。

有研究表明，LncRNA可以影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。例如，LncRNA CYTOR可以下調(diào)肺癌細(xì)胞對放療的敏感性，并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。本研究中，利用GEPIA數(shù)據(jù)庫查詢PXN-AS1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，相比正常對照組織，PXN-AS1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高；使用熒光定量PCR對4種肺癌細(xì)胞中PXN-AS1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，PXN-AS1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，且高表達(dá)PXN-AS1的患者，其預(yù)后要明顯差于PXN-AS1低表達(dá)的患者。以上結(jié)果提示，PXN-AS1在肺癌細(xì)胞和組織中高表達(dá)，且與肺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，PXN-AS1可能是一個肺癌相關(guān)的癌基因。在加用人參皂苷Rg3后，PXN-AS1的表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào)，這一結(jié)果表明人參皂苷Rg3可能通過調(diào)控PXN-AS1的表達(dá)來增加放射敏感性。

綜上所述，人參皂苷Rg3可能是潛在的放射增敏劑，可能通過調(diào)控PXN-AS1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的放射增敏。然而本研究僅從體外細(xì)胞實驗水平分析了人參皂苷Rg3對肺癌細(xì)胞放射治療的影響，下一步還需進(jìn)一步在分子水平及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路層面探討人參皂苷Rg3在肺癌放射治療中的作用和機(jī)制，以期為臨床治療提供新的思路。