周 聰 沈 霖 陳 瑞 胡 曼 盧芙蓉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

近些年來(lái)肥胖的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)急劇增加，肥胖與各種疾病密切相關(guān)，包括心血管疾病[1]、2型糖尿病[2]、高血壓、血脂異常[3]、肝臟疾病以及癌癥[4]等。研究[5]表明，肥胖通常表現(xiàn)為慢性低度炎癥并伴隨著胰島素抵抗。本課題組前期研究[6-9]表明，葫蘆巴提取物4-羥基異亮氨酸在體外可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(TNF converting enzyme，TACE)的活性來(lái)改善3T3-L1脂肪細(xì)胞和HepG2肝細(xì)胞的胰島素抵抗，而葫蘆巴在體內(nèi)是否仍可對(duì)肥胖相關(guān)炎癥和胰島素抵抗發(fā)揮改善作用還有待驗(yàn)證。本研究通過(guò)建立肥胖小鼠模型，觀察葫蘆巴治療對(duì)于炎癥因子、胰島素受體和JNK信號(hào)通路等的影響，探討葫蘆巴治療肥胖的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只雄性C57BL/6J小鼠(3周齡，17～18 g)，20只雄性瘦素缺陷型ob/ob小鼠(3周齡，18～19 g)均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，所有動(dòng)物飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 葫蘆巴湯劑的制備

將干燥的葫蘆巴種子磨成粉末，在蒸餾水中浸泡后煮沸。過(guò)濾器分離沉淀物，獲得葫蘆巴湯劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及喂養(yǎng)、給藥方式

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常飲食組(NC組)和高脂飲食組(HFD組)，每組各10只：NC組小鼠喂養(yǎng)正常飼料，HFD組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料。

將瘦素缺陷型ob/ob小鼠隨機(jī)分為葫蘆巴低劑量治療組(Fenu/L組)和葫蘆巴高劑量治療組(Fenu/H組)，每組各10只：Fenu/L組小鼠喂養(yǎng)正常飼料，12周后每天灌服低劑量葫蘆巴湯劑(0.1 mL/只)，持續(xù)12周；Fenu/H組小鼠喂養(yǎng)正常飼料，12周后每天灌服高劑量葫蘆巴湯劑(0.2 mL/只)，持續(xù)12周。

1.4 血清和脂肪樣本獲取

小鼠禁食過(guò)夜，通過(guò)腹主動(dòng)脈穿刺獲得血液1 mL，離心后取上清液在-20 ℃下保存。同時(shí)，分離皮下白色脂肪組織，在-80 ℃下保存。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血脂測(cè)定 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平。

1.5.2 胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算 采用手持血糖儀測(cè)量空腹血糖，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測(cè)空腹血清胰島素。

胰島素抵抗指數(shù)(insulin resistance index of homeostasismodel assessment，HOMA-IR)應(yīng)用自身穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法進(jìn)行計(jì)算，HOMA-IR =(空腹血糖×空腹血清胰島素)/22.5。

1.5.3 炎癥因子(IL-1β和IL-6)和趨化因子(MCP-1)測(cè)定 采用ELISA試劑盒測(cè)量血清中IL-1β、IL-6和MCP-1蛋白水平。

采用RT-qPCR檢測(cè)皮下脂肪組織中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)水平。使用總RNA抽提試劑(Trizol)從皮下脂肪組織中提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。然后在PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，95°C 10分鐘，95°C 30秒，60°C 30秒，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析計(jì)算，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

表1 用于RT-qPCR的引物序列

1.5.4 脂肪組織中胰島素受體和JNK信號(hào)通路測(cè)定 采用放射免疫沉淀試驗(yàn)(radio immunoprecipitation test，RIP)裂解液從皮下脂肪組織樣品中提取總蛋白。將蛋白質(zhì)樣品上樣5%或12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)中，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。將PVDF膜浸入含有5%脫脂奶粉的Tris Buffered Saline+Tween(TBST)緩沖液中，搖床封閉2 h，然后與特定的一抗在4 °C下孵育過(guò)夜。將PVDF膜浸入二抗孵育溶液中。洗滌后，將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑和穩(wěn)定的過(guò)氧化物酶溶液以1：1的比例混合顯色，通過(guò)iBright智能成像系統(tǒng)獲取圖片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行繪圖。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重比較

喂養(yǎng)12周后，HFD組、Fenu/L組、Fenu/H組小鼠體重均顯著高于NC組(P<0.05)，F(xiàn)enu/L組、Fenu/H組小鼠體重顯著高于HFD組(P<0.05)。

經(jīng)過(guò)12周葫蘆巴治療后，F(xiàn)enu/H組小鼠體重顯著低于HFD組、Fenu/L組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體重比較

2.2 血清TC、TG、LDL、HDL水平比較

HFD組小鼠血清TC、TG和LDL水平顯著高于NC組(P<0.05)，HDL水平顯著低于NC組(P<0.05)。

經(jīng)過(guò)12周葫蘆巴治療后，F(xiàn)enu/L組、Fenu/H組小鼠血清TC、TG和LDL水平顯著低于HFD組(P<0.05)，HDL水平顯著高于HFD組(P<0.05)；且Fenu/H組小鼠血清TC、LDL水平顯著高于Fenu/L組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠TC、TG、LDL、HDL水平比較

2.3 空腹血糖、空腹血清胰島素、HOMA-IR水平比較

HFD組小鼠空腹血糖、空腹血清胰島素和HOMA-IR水平顯著高于NC組(P<0.05)。

經(jīng)過(guò)12周葫蘆巴治療后，F(xiàn)enu/L組、Fenu/H組小鼠空腹血糖、空腹血清胰島素和HOMA-IR水平顯著低于HFD組(P< 0.05)；且Fenu/H組小鼠空腹血清胰島素和HOMA-IR水平顯著低于Fenu/L組(P< 0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠空腹血糖、空腹血清胰島素、HOMA-IR水平比較

2.4 血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平比較

HFD組小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平顯著高于NC組(P<0.05)。

經(jīng)過(guò)12周葫蘆巴治療后，F(xiàn)enu/L組、Fenu/H組小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平顯著低于HFD組(P<0.05)，且Fenu/H組小鼠血清IL-1β、IL-6水平顯著低于Fenu/L組(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠血清IL-1β、IL-6、MCP-1水平比較

2.5 皮下脂肪組織IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

HFD組小鼠皮下脂肪組織中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著高于NC組(P<0.05)。

經(jīng)過(guò)12周葫蘆巴治療后，F(xiàn)enu/L組、Fenu/H組小鼠皮下脂肪組織中IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均顯著低于HFD組(P<0.05)，且Fenu/H組顯著低于Fenu/L組(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠皮下脂肪組織IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.6 皮下脂肪組織p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4和c-JUN、p-c-JUN、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)比較

HFD組小鼠皮下脂肪組織中c-JUN、p-c-JUN、JNK和p-JNK的蛋白表達(dá)水平高于NC組，p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4的蛋白表達(dá)水平低于NC組。

經(jīng)過(guò)12周葫蘆巴治療后，F(xiàn)enu/L組、Fenu/H組小鼠皮下脂肪組織中c-JUN、p-c-JUN、JNK和p-JNK的蛋白表達(dá)水平低于HFD組，p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4的蛋白表達(dá)水平高于HFD組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠皮下脂肪組織p-IRS-1、p-PI3K、p-Akt、GLUT4和c-JUN、p-c-JUN、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖

3 討論

瘦素為肥胖基因(obese，ob)編碼產(chǎn)物，是脂肪細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)類(lèi)激素，在調(diào)節(jié)能量平衡、攝食行為方面起重要作用。瘦素缺陷型ob/ob小鼠是一種由于ob基因的純合子自發(fā)隱性突變而無(wú)法表達(dá)和分泌具有正常功能瘦素的遺傳性小鼠，在1950年由Ingalls成功繁育[10]。瘦素缺陷型ob/ob小鼠表現(xiàn)為食欲大增，體重劇增，產(chǎn)生嚴(yán)重的肥胖特征，是研究肥胖疾病的理想模型[11]。C57BL/6J小鼠通過(guò)高脂飼料連續(xù)干預(yù)12周可建立肥胖小鼠模型。

肥胖表現(xiàn)為一種低度的持續(xù)性炎癥狀態(tài)，在不同的代謝組織中引起氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致胰島素抵抗。肥胖的炎癥狀態(tài)是由免疫細(xì)胞(包括脂肪組織巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞)向代謝組織的浸潤(rùn)增加導(dǎo)致[13]。在肥胖人群中，脂肪組織巨噬細(xì)胞被稱(chēng)為M1型巨噬細(xì)胞，它釋放促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α，創(chuàng)造一個(gè)阻止脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素作用的促炎環(huán)境，從而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[14]。

趨化因子是一類(lèi)能趨化細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白，MCP-1屬于趨化因子家族的一個(gè)小細(xì)胞因子。MCP-1主要通過(guò)受體CC趨化因子受體(chemokine c-c-motif receptor，CCR)2實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)，可以激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，例如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)途徑等[15]。

胰島素抵抗的特征主要表現(xiàn)為胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)-1/PI3K/Akt途徑磷酸化水平降低從而導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)減少。脂肪組織巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子(例如IL-1β、IL-6和TNF-α)可激活胰島素靶細(xì)胞內(nèi)炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，例如JNK。在肥胖條件下，JNK的激活會(huì)刺激促炎性轉(zhuǎn)錄因子，包括核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF)-κB，從而導(dǎo)致胰島素受體底物的絲氨酸磷酸化，繼而干擾胰島素的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葫蘆巴可減輕ob/ob小鼠體重，并調(diào)節(jié)血脂，具有良好的抗肥胖作用；葫蘆巴可通過(guò)抑制炎癥因子(IL-1β、IL-6)及趨化因子(MCP-1)表達(dá)、限制JNK炎癥信號(hào)通路的激活而表現(xiàn)出抗炎特性，也可通過(guò)降低空腹血糖、空腹血清胰島素、HOMA-IR水平并誘導(dǎo)胰島素受體信號(hào)通路的激活而表現(xiàn)出明顯的改善胰島素抵抗效應(yīng)。

綜上所述，葫蘆巴具有良好的治療肥胖和改善胰島素抵抗作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子(IL-1β和IL-6)及趨化因子(MCP-1)，并抑制JNK信號(hào)通路的激活，最終實(shí)現(xiàn)其抗炎和改善胰島素抵抗的雙重功效。