薛玉玲，袁慶彬*，馮麗莉，張棟，康志遠(yuǎn)，王世杰

1(石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊，050221)2(河北省發(fā)酵乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊，050221) 3(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050018)

甲型副傷寒沙門氏菌是引起人類傷寒病的病原之一。傷寒病是一類消化道傳染病，可引起全身性感染，其臨床癥狀是高度多變的，從以低燒和輕度不適為特征的輕度病癥，到危及生命的全身性多種并發(fā)癥，包括腸穿孔、腸出血、腦病等[1]。該類疾病被列為乙類傳染病[2]。近些年，傷寒病仍然是全球范圍內(nèi)的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[3]，每年影響數(shù)百萬人，在我國發(fā)病率也呈上升趨勢。雖然抗生素(氯霉素、氨芐青霉素、甲氧氨嘧啶)將傷寒病的總死亡率降到了1%，但是隨著抗生素的使用，出現(xiàn)了具有多重耐藥性的菌株，如氟喹諾酮類藥物耐藥菌株[4]。2017年，世界衛(wèi)生組織將耐氟喹諾酮沙門氏菌列為對人類威脅最大的12類細(xì)菌之一[5]。因此，抗生素替代治療成為了研究熱點(diǎn)。

益生菌被驗(yàn)證具有多種健康功效，如抑菌[6]、抗炎[7]、抗過敏[8]、提高機(jī)體免疫力[9-10]、降血脂[11]、抗腫瘤[12]等。益生菌可以通過定植、分泌代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)腸道菌群、參與免疫等發(fā)揮其健康功效，甚至達(dá)到預(yù)防治療疾病的作用[13]。大量研究表明，益生菌對一些致病菌有良好的抑制拮抗作用。趙梓雯等[14]發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌YH68對鼠傷寒沙門氏菌有良好的抑菌作用，即使是在亞抑制濃度也能發(fā)揮其抑菌作用。KEMGANG等[15]發(fā)現(xiàn)，含鼠李糖乳桿菌S1K3 (MTCC5957)的發(fā)酵乳通過增強(qiáng)腸道黏膜免疫和非免疫保護(hù)機(jī)制對沙門氏菌產(chǎn)生抑制作用。林如琴等[16]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了嗜酸乳桿菌可以抑制致病菌大腸桿菌O157:H7在腸道內(nèi)定植。本研究通過研究含有嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種的益生菌乳飲料對甲型副傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)腹瀉模型小鼠的腸道菌群的影響，探究嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種對甲型副傷寒沙門氏菌的抑制作用及其作用機(jī)制，從而為預(yù)防緩解甲型副傷寒沙門氏菌感染提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所選樣品為益生菌飲料，某乳業(yè)有限公司提供，含有嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種，添加量為≥5×107CFU/瓶。嗜酸乳桿菌菌粉，動物雙歧桿菌乳亞種菌粉，石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司。甲型副傷寒沙門氏菌(SalmonellaparatyphiA) CMCC50973，中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心(CMCC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級BALB/c小鼠42只，6周齡，雌雄各半，由中國食品藥品檢定研究院動物中心提供。

1.3 益生菌飲料對甲型副傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)小鼠腹瀉的改善作用

1.3.1 腹瀉模型的構(gòu)建

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，通過沙門氏菌的飼喂構(gòu)建腹瀉模型小鼠12只。培養(yǎng)S.paratyphiA CMCC50973至OD值為2.0，菌量約為9×109CFU/mL。直接灌胃小鼠，連續(xù)3 d。

造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠出現(xiàn)腹瀉、無力、無食欲癥狀。

1.3.2 益生菌飲料對腹瀉模型小鼠的影響

將12只腹瀉模型小鼠分為2組，每組6只。對照組，每天正常飲用高壓純凈水；實(shí)驗(yàn)組，喂養(yǎng)益生菌飲料原液。喂養(yǎng)3 d，并在此過程中觀察小鼠腹瀉情況，之后代謝籠采集小鼠糞便，取200 μg提取糞便總基因組，利用絕對熒光定量法測定每組小鼠糞便中乳桿菌和雙歧桿菌含量。

1.3.3 益生菌對甲型副傷寒沙門氏菌的競爭性抑制作用

將12只普通小鼠，分為2組，每組6只。對照組，每天正常飲用高壓純凈水；實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)S.paratyphiA CMCC50973至OD值為2.0，菌量約為9×109CFU/mL，按1∶1的比例與益生菌飲料原液混合飼喂小鼠。連續(xù)喂養(yǎng)3 d，在此過程中觀察小鼠腹瀉情況，之后代謝籠采集小鼠糞便，取200 μg提取糞便總基因組，利用絕對熒光定量法測定每組小鼠糞便中乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量。

1.4 益生菌在小鼠腸道中的定植情況

將18只普通小鼠分3組，每組6只?？瞻捉M，每天正常引用高壓純凈水；實(shí)驗(yàn)1組，喂養(yǎng)益生菌飲料原液；實(shí)驗(yàn)2組，在益生菌飲料原液基礎(chǔ)上加入純?nèi)樗峋?，使其乳酸菌濃度約為5×107CFU/mL(相當(dāng)于小鼠每天飲用1瓶益生菌飲料的乳酸菌量)。

在喂養(yǎng)第5、8、10天，采集代謝籠小鼠糞便，取200 μg提取糞便總基因組，利用絕對熒光定量PCR法測定每組小鼠糞便中乳桿菌和雙歧桿菌含量。喂養(yǎng)10 d后，將小鼠致死，取小腸和大腸組織，提取腸組織的DNA，利用熒光定量PCR法測定組織內(nèi)的乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量。

1.5 熒光定量檢測益生菌

基于乳桿菌和雙歧桿菌的基因信息，設(shè)計(jì)特異性引物序列(表1)。乳桿菌的特異性片段長度為341 bp，雙歧桿菌的特異性片段長度為550 bp。將2種細(xì)菌特異性片段擴(kuò)增后連接質(zhì)粒，倍比稀釋后制成熒光定量所需的標(biāo)準(zhǔn)品，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取200 μg小鼠糞便，提取總基因組，通過熒光定量PCR測定CT值，進(jìn)而基于標(biāo)準(zhǔn)曲線確定菌數(shù)。

表1 熒光定量引物序列Table 1 Primers used in fluorescence quantification

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌飲料對腹瀉模型的影響

結(jié)果顯示，對照組小鼠腹瀉自愈緩慢，3 d后依然腹瀉，水樣便，每天多便；5 d后逐漸好轉(zhuǎn)，糞便呈現(xiàn)顆粒狀。實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)益生菌飲料原液1 d后，小鼠腹瀉停止，排便次數(shù)減少，便液濃稠；2 d后無腹瀉；3 d后恢復(fù)正常。腹瀉期間小鼠水樣便的采集和核酸提取很困難，糞便中除了沙門菌外，幾乎沒有檢測到乳桿菌及雙歧桿菌。待小鼠自愈、糞便成形后，取糞便測定乳桿菌及雙歧桿菌，結(jié)果如表2所示。

表2 腹瀉型小鼠自愈后糞便中益生菌數(shù)量Table 2 Probiotics counts in feces of diarrhea type mice after self-healing

由表2可知，實(shí)驗(yàn)組的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量高于空白對照組，提示益生菌飲料不僅能抑制病原菌，還能通過增加2種益生菌的含量改善腹瀉。

2.2 益生菌與甲型副傷寒沙門氏菌對普通小鼠腸道的影響

連續(xù)飼喂3 d后，與對照小鼠相比，同時(shí)飼喂沙門氏菌和益生菌飲料原液，小鼠活動力略有下降，食欲無明顯差異，未出現(xiàn)水樣便和腹瀉。顯示益生菌飲料中的乳桿菌和雙歧桿菌具有競爭性抑制甲型副傷寒沙門氏菌的作用，從而對腸道起到了保作用。連續(xù)飼喂益生菌飲料和病原菌3 d，停2 d，第5天后的定量結(jié)果基本同正常小鼠，見表3。

表3 普通小鼠受試后5 d糞便中益生菌數(shù)量Table 3 Probiotics counts in feces of normal mice 5 days after test

2.3 益生菌在腸道菌群的定植情況

由圖1-a可知，3組小鼠糞便中的乳桿菌菌數(shù)在5 d時(shí)變化不顯著，隨著時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)1組和2組的乳桿菌含量在8、10 d時(shí)較空白對照組明顯增加。從圖1-b可知，雙歧桿菌變化明顯，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組在第5、8、10天，糞便中雙歧桿菌的含量均比空白組明顯增加。

a-乳桿菌；b-雙歧桿菌圖1 益生菌飲料對小鼠腸道乳桿菌和雙歧桿菌的影響Fig.1 Effect of probiotic beverage on intestinal L.acidophilus and B.animalis subsp.lactis in mice

實(shí)驗(yàn)組的腸組織DNA中，未能檢測到乳桿菌及雙歧桿菌。為了進(jìn)一步探究菌株在腸道的定植情況，采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌選擇性培養(yǎng)。取腸道和胃部組織于1 mL的MRS培養(yǎng)基中，充分混勻，取上清液200 μL涂布平板，厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)取總值，結(jié)果如表4所示。

表4 胃腸道組織內(nèi)的益生菌數(shù)Table 4 Probiotics counts in gastrointestinal tissues

從培養(yǎng)結(jié)果可以看出，隨著飼喂時(shí)間的延長，胃部乳桿菌數(shù)在增加，但未檢測到雙歧桿菌；腸道內(nèi)的乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)目均隨著喂養(yǎng)時(shí)間的增加呈上升趨勢。

3 結(jié)論

本研究探究了嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種益生菌飲料改善甲型副傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)小鼠的腹瀉作用。從結(jié)果看，不管在對腹瀉模型小鼠還是在益生菌和沙門氏菌同時(shí)作用普通小鼠的實(shí)驗(yàn)中，益生菌飲料都發(fā)揮了抑制病原菌的作用，緩解了模型小鼠的腹瀉癥狀，也預(yù)防普通小鼠感染沙門氏菌出現(xiàn)腹瀉的癥狀，說明該款益生菌飲料中的嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種在應(yīng)用中保持了一定的穩(wěn)定性，能夠發(fā)揮對甲型副傷寒沙門氏菌的抑制功效。

目前，已發(fā)現(xiàn)的益生菌健康功效的作用機(jī)制有很多，抑制病原菌改善腹瀉的作用機(jī)制可能有腸道內(nèi)競爭性的占位、提高腸道益生菌數(shù)量、產(chǎn)生抑菌素、增強(qiáng)免疫力等[17]。而益生菌在腸道內(nèi)的定植、黏附是這些作用機(jī)制的基礎(chǔ)[18]。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證益生菌作用機(jī)制，從糞便和腸道組織兩方面，探究了益生菌在小鼠腸道定植情況。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量與對照組相比明顯增加，同時(shí)隨著飼喂時(shí)間的增加益生菌也呈增加趨勢，從結(jié)果可以推斷這2株菌具有良好的定植能力。同時(shí)胃腸道組織內(nèi)經(jīng)過培養(yǎng)也檢測到了2種益生菌，且隨飼喂時(shí)間的延長益生菌的數(shù)目也在增加，進(jìn)一步直觀驗(yàn)證了2種益生菌具有定植能力。本研究中的嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種的定植存在差異，從結(jié)果看嗜酸乳桿菌的定植能力要高于動物雙歧桿菌乳亞種，正如王夢穎等[19]以小鼠為實(shí)驗(yàn)動物模型，對6株乳桿菌在腸道的定植能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌株之間的定植能力存在差異。但不同菌株定植的差異，是受何種因素影響，比如菌株本身、腸道環(huán)境、受體等，仍需要進(jìn)一步的研究。

本研究從益生菌的應(yīng)用產(chǎn)品入手，發(fā)現(xiàn)益生菌在應(yīng)用后仍具有改善甲型副傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)小鼠腹瀉的作用，在進(jìn)一步的機(jī)制探究中發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種具有一定的抑制病原菌和在腸道定植的能力。因此，提示嗜酸乳桿菌和動物雙歧桿菌乳亞種在拮抗甲型副傷寒沙門氏菌具有良好的應(yīng)用價(jià)值，為甲型副傷寒沙門氏菌相關(guān)感染的治療提供了新思路。