周子寒，劉琦琦，郝海寧，仝令君，劉同杰，公丕民，張?zhí)m威，易華西

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島，266000)

外泌體是直徑在40～160 nm，由細胞內(nèi)體形成的胞外囊泡，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，主要成分包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA、氨基酸及各種代謝產(chǎn)物等[1]。研究表明，外泌體中的核酸、蛋白質(zhì)等成分具有傳遞遺傳信息，調(diào)節(jié)生理功能等特性[2-3]。不同來源的外泌體對不同受體細胞的影響存在差異[4]。目前對外泌體的應(yīng)用研究主要集中在疾病診斷、藥物輸送等方面[5]。

乳汁作為哺乳動物幼體的主要營養(yǎng)來源，含有多種營養(yǎng)素及生長調(diào)節(jié)因子、免疫相關(guān)因子等重要生理活性物質(zhì)[6]。WALSH等[7]指出，母乳能夠為嬰幼兒構(gòu)建最為理想的腸道菌群。外泌體作為乳汁重要成分之一，能夠攜帶和傳遞miRNA等信號分子，已成為目前食源外泌體的研究熱點[8]。人體在攝入乳汁的過程中，乳源外泌體與腸道菌群間的相互作用不可避免，因此牛乳外泌體可能會對腸道內(nèi)的各種益生菌生長及功能產(chǎn)生影響。

牛乳或母乳等乳源外泌體已被證明具有免疫調(diào)節(jié)、促進腸道上皮細胞增殖等生理功能[9-10]。YU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乳源外泌體可以促進大腸桿菌K-12 MG1655以及植物乳桿菌WCFS1的生長，調(diào)節(jié)細菌的基因表達。TONG等[12]指出，口服牛乳胞外囊泡調(diào)節(jié)了小鼠的腸道菌群，增強了小鼠的腸道免疫力。TENG等[13]證實，外泌體可調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、影響腸道菌群生長。腸道菌群作為人體的一種重要“消化器官”，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、腸道穩(wěn)態(tài)、營養(yǎng)吸收、能量獲取等過程進一步影響人體健康[14]，同時擁有自己獨特的調(diào)節(jié)方式，維持著正常的動態(tài)平衡。

雙歧桿菌是益生菌的重要組成部分，對人體生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等益生功能有較多影響[15]。關(guān)于牛乳外泌體對腸道菌群中雙歧桿菌等益生菌影響的研究報道不多，且大多并未探究牛乳外泌體對益生菌益生特性的影響，因此進一步探究牛乳外泌體對腸道益生菌生長及其功能的影響對研究與開發(fā)乳源外泌體具有重要意義。動物雙歧桿菌F1-3-2是本實驗室前期從嬰幼兒糞便中分離得到的1株具有改善炎癥等生理功能的益生菌。而耐受人體消化道是益生菌在腸道定植并進一步發(fā)揮作用的前提條件之一，益生菌必須能通過消化道等特殊生理環(huán)境并保持一定濃度方可發(fā)揮益生功能。此外，利用體外細胞模型的黏附性可間接反映出菌株黏附腸道上皮細胞的能力，細胞黏附性越強，菌株定植能力越強。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步探索了牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2生長及其益生特性的影響，旨在為牛乳外泌體作為新型益生元的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：CCK-8、2%磷鎢酸、胰酶、胃蛋白酶、Triton X-100，北京索萊寶生物有限公司；BCA試劑盒、蛋白Marker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；TSG101抗體(一抗)，上海Abcam公司；CD81抗體(一抗)，美國Gene Tex公司；HRP二抗，上海斯信生物科技有限公司。

主要儀器：TGL-16M臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀有限公司；CP70ME超高速落地離心機，日本Hitachi公司；Multiskan FC酶標儀，Thermo Fisher公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏有限公司；DYCZ-24F雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠；ZetaView PMX 110 納米粒度追蹤儀，德國Particle Metrix 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛乳外泌體的提取鑒定

4 ℃條件下，參照TONG等[16]的方法，通過超速離心法提取牛乳外泌體。通過BCA試劑盒測定牛乳外泌體濃度。之后通過透射電鏡、納米顆粒追蹤技術(shù)、免疫印跡實驗對提取到的牛乳外泌體溶液進行鑒定，具體操作如下：

(1)超速離心法：通過凝乳酶分離鮮牛乳中的乳清，過0.22 μm濾膜后備用。使用超速離心機以100 000×g離心60 min，吸取上清液后再以135 000×g離心90 min，最后將沉淀的外泌體重懸于PBS中，100 000×g離心60 min。將完成離心的牛乳外泌體溶液移至100 kDa超濾管進行超濾，PBS復(fù)溶后于-80 ℃保存。

(2)透射電鏡：移取10 μL溶解于PBS的外泌體及磷鎢酸溶液，滴加至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，夾取銅片，將碳面浸入外泌體溶液浸染1 min后夾取銅片，用濾紙吸去多余外泌體，再將碳面浸入磷鎢酸溶液負染1 min，吸去多余磷鎢酸后放入培養(yǎng)皿，常溫干燥，干燥后在透射電鏡80 kV下觀察外泌體形態(tài)及大小。

(3)納米顆粒追蹤技術(shù)：使用PBS稀釋外泌體樣品后，使用110 nm聚苯乙烯顆粒校準ZetaView系統(tǒng)，使用ZetaView PMX 110進行檢測，通過ZetaView 8.04.02軟件分析粒度及濃度。

(4)免疫印跡法：提取牛乳外泌體蛋白后，進行SDS-PAGE分析。制備5%/10%SDS-PAGE，上樣20 μL后，在80 V條件下使樣品達到分離膠，120 V條件下使樣品達到分離膠底部。電泳完成后，根據(jù)Marker確定CD81、TSG101、Alix對應(yīng)條帶，PVDF膜浸入甲醇溶液激活后在80 V條件下轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜置入5%牛血清白蛋白的TBST緩沖液中封閉60 min；再次加入TBST洗滌3次，每次15 min。按V(一抗)∶V(一抗稀釋液)=1∶1 000加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜。再次用TBST洗滌3次后，按V(一抗)∶V(二抗稀釋液)=1∶5 000加入二抗，室溫搖床孵育60 min，TBST洗滌3次。按照V(A液)∶V(B液)=1∶1的比率配制發(fā)光液，將發(fā)光液滴加在PVDF膜上曝光拍照。

1.2.2 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2生長過程的影響

將凍存管保存的菌株以2%(體積分數(shù))的接種量轉(zhuǎn)接至10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)，復(fù)蘇后傳代使用。實驗組中添加外泌體溶液使其蛋白質(zhì)量濃度為100 μg/mL，對照組中添加等量PBS，48 h內(nèi)每隔4 h取樣，在600 nm處測定吸光度，繪制生長曲線。

設(shè)置外泌體低、中、高劑量組，溶液蛋白濃度100 μg/mL(EXO-LOW)、150 μg/mL(EXO-MID)、200 μg/mL(EXO-HIGH)，干預(yù)24 h后與對照組同時進行活菌計數(shù)，測定不同濃度牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2生長的影響。

1.2.3 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2胃腸環(huán)境耐受性的影響

向PBS中不斷滴加0.1 mol/L的鹽酸至pH=3為止，用以模擬胃腸道酸性環(huán)境。向PBS中添加豬膽鹽，配制質(zhì)量分數(shù)為0.5%的膽鹽溶液備用。向PBS中添加胰酶，配制質(zhì)量分數(shù)為0.9%的胰酶溶液用以模擬胃腸道胰酶消化環(huán)境。向pH 2的PBS中添加胃蛋白酶，配制質(zhì)量分數(shù)為0.3%的胃蛋白酶溶液用以模擬胃蛋白酶消化環(huán)境。

將活化后的動物雙歧桿菌F1-3-2菌株轉(zhuǎn)接至酸性環(huán)境中，實驗組添加低、中、高劑量牛乳外泌體，對照組添加等量PBS。37 ℃下1.5、3 h后分別取出，進行活菌計數(shù)，測定牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2耐酸性的影響。

將活化后的動物雙歧桿菌F1-3-2菌株轉(zhuǎn)接至MRS肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.02%，用以模擬胃腸道膽鹽環(huán)境。實驗組添加低、中、高劑量牛乳外泌體，對照組添加等量PBS，37 ℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h后取出，進行活菌計數(shù)，測定牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2膽鹽耐受性的影響。

將活化后的動物雙歧桿菌F1-3-2菌株分別轉(zhuǎn)接至胰酶及胃蛋白酶消化環(huán)境中，實驗組添加低、中、高劑量牛乳外泌體，對照組添加等量PBS。37 ℃環(huán)境中1.5、3 h后分別取出，進行活菌計數(shù)，測定牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2胰酶及胃蛋白酶耐受性的影響。

1.2.4 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2細胞黏附性的影響

根據(jù)SIDIRA等[17]的方法，將活化后的Caco-2細胞傳代，細胞計數(shù)后以各孔細胞數(shù)1×105鋪板，37 ℃培養(yǎng)24 h后各孔添加動物雙歧桿菌F1-3-2菌體至109CFU/mL，實驗組添加牛乳外泌體使其質(zhì)量濃度為100、150、200 μg/mL；對照組添加等量PBS，于CO2培養(yǎng)箱中共孵育16 h。用無菌PBS洗滌5次，除去未黏附的雙歧桿菌，1 mL 1%(質(zhì)量分數(shù))Triton X-100裂解細胞20 min，進行活菌計數(shù)，測定牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2細胞黏附性的影響。

1.2.5 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2抗炎特性的影響

將活化后的Caco-2細胞傳代，細胞計數(shù)后以各孔細胞數(shù)1×105鋪板，37 ℃培養(yǎng)24 h后實驗組各孔以細菌數(shù)∶細胞數(shù)=100∶1的數(shù)量添加動物雙歧桿菌F1-3-2菌體，之后添加牛乳外泌體使其質(zhì)量濃度分別為0、100、150、200 μg/mL；空白對照組為等量PBS，37 ℃干預(yù)16 h后各孔添加10% CCK-8溶液，孵育1 h后使用酶標儀測量450 nm處吸光度，細胞存活率按公式(1)計算：

(1)

式中,A0，空白對照組450 nm處吸光度；A，實驗組450 nm處吸光度。

將活化后的Caco-2細胞傳代，細胞計數(shù)后以各孔細胞數(shù)1×105鋪板，37 ℃培養(yǎng)24 h后使用2 μg/mL的脂多糖誘導(dǎo)構(gòu)建炎癥細胞模型，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后實驗組各孔以細菌數(shù)∶細胞數(shù)=100∶1的數(shù)量添加動物雙歧桿菌F1-3-2菌體，之后添加牛乳外泌體使其質(zhì)量濃度分別為0、100、150、200 μg/mL；空白對照組為等量PBS，37 ℃干預(yù)16 h，收集炎癥細胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心10 min收集培養(yǎng)上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，測定各培養(yǎng)液中炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β的水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(P<0.05)。相同字母代表無顯著差異，不同字母代表差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳外泌體的提取與鑒定

采用超速離心法提取牛乳外泌體后，利用透射電鏡觀察牛乳外泌體形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。提取的牛乳外泌體為雙層膜結(jié)構(gòu)的近似球體，其直徑為30～200 nm，具有外泌體的典型形態(tài)特征，同時提取的外泌體雜質(zhì)較少。目前，外泌體的提取方法主要包括超速離心法、免疫親和捕獲法、化學(xué)沉淀法等[18]。本研究結(jié)果表明超速離心法可以實現(xiàn)牛乳外泌體的提取分離。

圖1 牛乳外泌體透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of bovine milk exosomes

粒度大小是外泌體鑒定的重要指標之一。圖2為牛乳外泌體粒徑分布圖及其顆粒濃度。通過超速離心法提取獲得的牛乳外泌體粒徑分布在100～200 nm，與透射電鏡觀察到的結(jié)果基本一致，粒徑大小符合外泌體的定義。

圖2 牛乳外泌體粒徑分布及其濃度Fig.2 Particle size distribution and concentration of bovine milk exosomes

特異性標記蛋白是外泌體鑒定的另一重要指標。外泌體外膜及內(nèi)容物中存在許多特異性標記蛋白，這些特異性蛋白可以輔助鑒定外泌體，包括CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix等[19]。利用免疫印跡法對提取的牛乳外泌體的標志性蛋白進行了測定，結(jié)果如圖3所示。提取的牛乳外泌體樣本中檢測到了外泌體標志性蛋白CD81、TSG101、Alix，表明超速離心法可成功提取牛乳外泌體。

圖3 牛乳外泌體特異性標記蛋白Fig.3 Specific marker protein of bovine milk exosomes

2.2 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2生長過程的影響

牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2生長的影響如圖4-a所示，牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2的生長促進顯著，在24、28 h時促進效果最為顯著，添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，菌濃度提升了1.8倍。進一步對外泌體濃度是否會影響促生長效果進行了探究，結(jié)果如圖4-b所示。牛乳外泌體在低、中、高劑量下均對動物雙歧桿菌F1-3-2生長有顯著促進效果(P<0.05)，但牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2的促生長效果無明顯劑量依賴性。

a-生長曲線；b-牛乳外泌體劑量對活菌數(shù)的影響圖4 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2生長過程的影響Fig.4 Effects of bovine milk exosomes on the growth of B.animalis F1-3-2

2.3 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2腸胃環(huán)境耐受性的影響

如圖5所示，牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在酸性環(huán)境(pH 3.0)中存活率具有明顯的改善作用。添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，動物雙歧桿菌F1-3-2在酸性環(huán)境保持1.5 h的存活率由43.0%提升至76.3%(P<0.05)，保持3.0 h后，存活率由34.3%提升至74.4%(P<0.05)。牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2酸性條件下的保護作用無明顯劑量依賴性。

a-1.5 h存活率；b-3.0 h存活率圖5 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2耐酸性的影響Fig.5 Effects of bovine milk exosomes on the acid resistance of B.animalis F1-3-2

牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境存活率的影響如圖6所示。

圖6 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2膽鹽耐受性的影響Fig.6 Effects of bovine milk exosomes on the bile salt resistance of B.animalis F1-3-2

牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境中的存活率具有明顯的提高作用。添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，動物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境24 h存活率由原來的34.1%提升至90.1%(P<0.05)。牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在膽鹽環(huán)境的保護作用無明顯劑量依賴性。

牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在胃腸道蛋白酶環(huán)境下存活率的影響如圖7所示。牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在胰酶環(huán)境中的存活率具有一定程度的提高作用，中劑量牛乳外泌體(150 μg/mL)改善作用最為顯著，動物雙歧桿菌F1-3-2在胰酶環(huán)境中保持1.5 h后的存活率提升了38%(P<0.05)，保持3.0 h后的存活率提升了20%。

a-1.5 h存活率；b-3.0 h存活率圖7 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2胰酶耐受性的影響Fig.7 Effects of bovine milk exosomes on the trypsin resistance of B.animalis F1-3-2

牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2在胃蛋白酶環(huán)境下存活率的影響如圖8所示。F1-3-2在胃蛋白酶(pH=3.0)條件下作用3 h后存活率幾乎為0，而牛乳外泌體有效提升了其在胃蛋白酶環(huán)境中的存活率。添加低劑量牛乳外泌體(100 μg/mL)后，動物雙歧桿菌F1-3-2在胃蛋白酶環(huán)境保持1.5 h的存活率由18.8%提升至35.7%(P<0.05)，保持3.0 h的存活率由0.5%提升至20.7%(P<0.05)。

a-1.5 h存活率；b-3.0 h存活率圖8 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2胃蛋白酶耐受性的影響Fig.8 Effects of bovine milk exosomes on the pepsin resistance of B.animalis F1-3-2

2.4 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2黏附性的影響

由圖9可知，牛乳外泌體能夠顯著提高動物雙歧桿菌F1-3-2菌株對Caco-2細胞的黏附性能(P<0.05)。隨著牛乳外泌體劑量增大，影響效果更為顯著。相比于對照組，高劑量牛乳外泌體(200 μg/mL)干預(yù)后，動物雙歧桿菌F1-3-2菌株對Caco-2細胞的黏附能力上升了1.16倍(P<0.05)。

圖9 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2黏附性的影響Fig.9 Effects of bovine milk exosomes on the adhesion of B.animalis F1-3-2

2.5 牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2抗炎特性的影響

牛乳外泌體和動物雙歧桿菌F1-3-2前期均已被證實具有一定的抗炎活性。由圖10可知，低劑量牛乳外泌體與動物雙歧桿菌F1-3-2共同作用表現(xiàn)出了最佳抗炎效果。與對照組相比，其細胞上清液中TNF-α含量下降了29.3%(P<0.05)，IL-1β含量下降了14.5%(P<0.05)，抗炎效果優(yōu)于動物雙歧桿菌F1-3-2。隨著牛乳外泌體劑量增大，牛乳外泌體與動物雙歧桿菌F1-3-2協(xié)同抗炎效果反而降低，可能是由于牛乳外泌體同時促進了Caco-2細胞的生長所導(dǎo)致，炎癥細胞的增多導(dǎo)致了炎癥細胞因子水平的升高。

a-TNF-α水平；b-IL-1β水平圖10 牛乳外泌體及動物雙歧桿菌F1-3-2對炎癥因子水平影響Fig.10 Effects of bovine milk exosomes and B.animalis F1-3-2 on the level of inflammatory cytokines

3 結(jié)論

牛乳外泌體對動物雙歧桿菌F1-3-2的生長具有明顯的促進作用，同時也能夠提高動物雙歧桿菌F1-3-2對腸胃環(huán)境的耐受性和黏附性能。牛乳外泌體與動物雙歧桿菌F1-3-2體現(xiàn)出協(xié)同抗炎特性，相關(guān)炎癥因子水平顯著下調(diào)。牛乳外泌體有望作為一種新型益生元，發(fā)揮促進益生菌生長、提高益生功能等作用。