何 涵 冶亞平 陰常欣 周玲玲 昌 媛 李婷婷▲

1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科，廣東廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系，廣東廣州 510515

結直腸癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴重威 脅人類生命健康[1]，闡明結直腸癌發(fā)生的分子機制，對結直腸癌進行早期診斷和預后評估是結直腸癌研究的重要內(nèi)容。

腫瘤組織中存在具有自我更新和不斷增殖能力的細胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，這些細胞被稱為腫瘤干細胞（tumor stem cell，TSC）[2]。TSC極強的運動和遷徙能力能促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[3]。B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入位點1（B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion site-1，BMI1）基因是多梳基因家族中重要的調(diào)控基因，在維持腫瘤干細胞的自我更新及多向分化的過程中起著重要作用[4-6]。BMI1的過表達可以促進腸癌的增殖并誘導癌細胞出現(xiàn)化療抵抗[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-365a-3p可以靶向結合BMI1，而miR-365a-3p在結直腸癌中的作用在國內(nèi)外少見報道，本研究通過檢測miR-365a-3p在結直腸癌組織中的表達，觀察其對結直腸癌細胞增殖能力和干細胞特性的影響，明確其抑制結直腸癌發(fā)生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑儀器及細胞株

1.1.1 試劑 血清（美國Gibco）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本寶生物），PCR試劑盒（日本寶生物）；BMI1質(zhì)粒、miR-365a-3p、抑制劑及其空白對照均購自廣州銳博生物公司；CCK8（東仁公司）。

1.1.2 儀器 CO2孵箱（上海潤度）；顯微鏡（德國萊卡）；離心機（德國艾本德）；酶標儀（深圳匯松）；紫外分光光度計（上海箐華）。

1.1.3 細胞株 HCT15和SW620購自美國ATCC公司。

1.2 臨床標本收集

收集南方醫(yī)院2018年9月至2019年9月住院患者的結直腸癌標本，本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 提取RNA

按照試劑說明書提取RNA，通過紫外分光光度計測定RNA的濃度及純度。

1.4 Q-PCR

①按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄提取好的RNA。②用PCR試劑盒檢測miR-365a-3p和基因的表達，引物序列見表1。反應條件：95℃ 6 min、95℃ 15 s、60℃ 32 s、72℃ 32 s，40個循環(huán)。U6及GAPDH為內(nèi)參，重復3次。

表1 引物序列

1.5 熒光素酶報告實驗

①利用在線網(wǎng)站TargetScanHuman 7.2預測miR-365a-3p的靶基因。②構建BMI1野生型及突變型的熒光素酶載體，分別與對照組（空白）、實驗組（miR-365a-3p）、干擾組（miR-365a-3p抑制劑）共轉(zhuǎn)染至結腸癌細胞。48 h后，按熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒的說明書檢測細胞的熒光素酶活性。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細胞，以5×105個/孔接種于6孔板中。12 h后，按照Lipo3000試劑說明書，分別轉(zhuǎn)染實驗組、對照組及干擾組質(zhì)粒。

1.7 CCK8實驗

取對數(shù)生長期的細胞，按1×103個/孔接種至96孔板中，每孔加100 μl培養(yǎng)液，每組設5個復孔。在待測定孔中加入CCK8，2 h后用酶標儀檢測實驗組、對照組及干擾組吸光度值，連續(xù)測7 d，重復3次，繪制細胞增殖曲線。

1.8 干細胞成球?qū)嶒?/h3>

取對數(shù)生長期的細胞，PBS洗兩次以去除血清。用5 ml干細胞培養(yǎng)基（成分：DMEM+B27+FGF+EGF）重懸細胞，按5×102個/孔鋪到24孔超低吸附板中，補加干細胞培養(yǎng)基400 μl。12 d后觀察干細胞球的狀態(tài)及數(shù)目。成球率=每孔中直徑＞75 μm的細胞球的個數(shù)/原始接種細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。CCK8增殖能力比較用Two-way ANOVA；相關性分析用Spearman相關檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中miR-365a-3p的表達檢測

miR-365a-3p在正常組織中的表達高于癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.148，P=0.015），見圖1A。miR-365a-3p在T1～T2期患者中的表達高于T3～T4期，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.676，P=0.027），見圖1B。

圖1 miR-365a-3p在結直腸癌組織中的表達

2.2 miR-365a-3p與BMI1的結合情況

生物信息學網(wǎng)站預測出miR-365a-3p與BMI1的3’UTR區(qū)結合位點，見圖2A，實驗組雙熒光素酶的數(shù)值明顯下降，對照組雙熒光素酶的數(shù)值無明顯變化，實驗組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.112，P=0.013），見圖2B。

圖2 BMI1與miR-365a-3p的結合情況

2.3 BMI1的表達情況

Q-PCR結果顯示實驗組BMI1表達下降（t=6.378、5.784，P=0.004、0.005），干 擾 組BMI1表達升高（t=8.547、9.651，P=0.003、0.002），差異均有統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 BMI1的表達情況

2.4 CD44、CD133及Lgr5的表達情況

與對照組相比，實驗組CD44、CD133及Lgr5的表達下降（t=9.232、8.774、6.155，P=0.012、0.010、0.017），見圖4A；而干擾組CD44、CD133及Lgr5的表達升高（t=5.271、6.157、5.125，P=0.032、0.029、0.033），見圖4B，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。

圖4 干細胞相關基因的表達

2.5 結直腸癌細胞增殖能力檢測

CCK8實驗表明，實驗組細胞的增殖能力低于對照組，干擾組細胞的增殖能力高于對照組，第5天差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖5。

圖5 CCK8檢測細胞增殖能力

2.6 結直腸癌干細胞特性檢測

干細胞成球?qū)嶒灡砻鳎瑢嶒灲M干細胞成球數(shù)低于對照組（t=17.341、19.232，P=0.004、0.002），見圖6A，而干擾組干細胞成球數(shù)高于對照組（t=8.212、5.473，P=0.017、0.041），見圖6B，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。

圖6 干細胞成球情況

3 討論

miRNA是一類在真核細胞中廣泛存在的非編碼小RNA的總稱，其主要通過誘導靶基因降解起到翻譯抑制作用[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA可以通過靶向結合干細胞相關基因誘導腫瘤細胞凋亡，如miR-34a可通過結合CD44抑制乳腺癌干細胞的增殖[13]，miR-150可通過抑制肝癌細胞中C-myc、Bcl-2的表達而影響肝癌干細胞的特性[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-365a-3p在結直腸癌組織中表達降低，并且其表達與患者T分期相關，miR-365a-3p低表達的患者分期較差；生物信息學軟件及熒光素酶報告系統(tǒng)實驗證實，miR-365a-3p與BMI1的3’UTR區(qū)有結合位點，miR-365a-3p可抑制干細胞相關基因BMI1、CD44、CD133及Lgr5的表達，使結直腸癌干細胞的成球能力下降，并抑制癌細胞的增殖能力。但腫瘤的發(fā)生發(fā)展是極其錯綜復雜的過程，本研究還需要繼續(xù)驗證和探索。

綜上所述，miR-365a-3p是一種抑制結直腸癌發(fā)生的重要microRNA，其通過調(diào)節(jié)BMI1的表達，影響結直腸癌干細胞特性，抑制結直腸癌細胞的增殖。本研究將為結直腸癌的預防、治療和藥物研制提供新思路和新靶標。