鄭飛洋,戴志遠,2*,崔益瑋
(1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012)
根據(jù)有無雙鍵以及雙鍵的數(shù)目,可將脂肪酸分為飽和脂肪酸(Saturated fatty acids,SFAs)、單不飽和脂肪酸 (Monounsaturated fatty acids,MUFAs)和多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs),其中又以雙鍵位置的差異,將PUFAs 主要分為ω-3 和ω-6 型,如圖1所示。多年來ω-3 PUFAs,尤其是EPA 和DHA 的健康益處一直是各機構(gòu)組織以及各國研究的熱點。大量研究證實,ω-3 PUFAs 具有廣泛的生理作用,主要包括抗炎,抑制癌癥,預(yù)防心血管疾病,促進神經(jīng)和視覺系統(tǒng)的發(fā)育等[1-4]。海洋生物含有豐富的ω-3 PUFAs,是人類獲取EPA 和DHA 最主要的膳食來源。本文從膳食結(jié)構(gòu)、來源、體內(nèi)代謝和分離純化方法4 個方面綜述海洋生物中ω-3 PUFAs 的研究進展,旨在為ω-3 PUFAs 的進一步探索提供理論參考。
圖1 植物和動物性飲食中發(fā)現(xiàn)的主要脂肪酸的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of major fatty acids found in plant and animal based diet
近幾十年來,隨著我國工業(yè)化快速推進和經(jīng)濟高速發(fā)展,人們?nèi)粘o嬍持笑?3 PUFAs 與ω-6 PUFAs 的比例發(fā)生了巨大變化,ω-6 PUFAs 的比例相對較高,而ω-3 PUFAs 比例相對降低[5]。據(jù)報道,西方高脂肪飲食習(xí)慣導(dǎo)致其居民ω-3/ω-6 攝入比例為1/15~20,印度的ω-3/ω-6 攝入比甚至僅為1/30~70,遠低于1/4 的推薦值[6-7]。由于ω-6 PUFAs 產(chǎn)生炎癥介質(zhì),而ω-3 PUFAs 產(chǎn)生中性或抗炎信號分子,ω-3/ω-6 失衡不僅會導(dǎo)致慢性炎癥的出現(xiàn),而且增加了關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、癡呆癥等疾病的患病率[6]。由此可見,體內(nèi)ω-3/ω-6 的平衡對維持人體正常新陳代謝具有重要的生理意義。
一般人體獲取ω-3 PUFAs 有2 條途徑:自身合成和膳食攝入。然而,人體內(nèi)大部分的ALA 通過β-氧化為機體供能,只有少部分能夠轉(zhuǎn)化為EPA 和DHA[8]。研究表明,從ALA 轉(zhuǎn)化而來的EPA 只有5%~10%,而由ALA 轉(zhuǎn)化為DHA 的轉(zhuǎn)化率不足1%[9]。由此可見,人體低EPA 和DHA 合成量并不能滿足人體正常所需。并且如圖2所示,相較于植物ω-3 和ω-6 PUFAs 代謝途徑,由于動物體內(nèi)缺乏Δ12 脂肪酸脫飽和酶 (Δ12 Fatty acid desaturase,F(xiàn)ADS12)和Δ15 脂肪酸脫飽和酶(FADS15),導(dǎo)致其LA 與ALA 合成途徑均受到阻礙。此生理差異致使人體內(nèi)的ω-6 PUFAs 無法轉(zhuǎn)化為ω-3 PUFAs,同時也意味著食物中ω-3/ω-6 PUFAs 的攝入比例最終將影響人體內(nèi)ω-3/ω-6 PUFAs 之比。因此,人們?nèi)粘o嬍持行韬侠硌a充ω-3 PUFAs,特別是EPA 和DHA。如圖2所示,每日EPA 和DHA 的攝入量應(yīng)不少于0.1 g,以此將ω-3/ω-6 PUFAs 之比維持在正常范圍。
圖2 ω-3 和ω-6 脂肪酸代謝途徑[8,15]Fig.2 ω-3 and ω-6 fatty acid metabolism pathway[8,15]
表1 各組織與協(xié)會EPA 和DHA 推薦攝入量Table 1 Recommended intake of EPA and DHA by organizations and associations
海洋中含有豐富的自然資源,是人類獲取ω-3 PUFAs 最主要的來源。如表2所示,藻類、魚類、甲殼類、貝類、海洋哺乳類都富含ω-3 PUFAs,因此日常飲食中增加魚、蝦、蟹類海產(chǎn)品的攝入是預(yù)防或調(diào)節(jié)機體ω-3/ω-6 PUFAs 失衡的重要途徑。海洋中的魚類種類繁多,分布海域廣,不僅是人們獲取EPA 和DHA 的主要途徑,而且還是補充脂溶性維生素A 和維生素D 的理想來源,通常以食品或魚油形式的保健食品進行補充[16]。于是,在營養(yǎng)價值和商業(yè)價值的驅(qū)動下,如金槍魚、鯡魚、鱈魚、三文魚等含有豐富的EPA 和DHA 的魚類逐漸成為熱門的經(jīng)濟魚類[6]。相較于魚類,蝦、蟹、貝類等海洋生物含有較高的磷脂(Phospholipids,PLs)[10]。研究表明,ω-3 PUFAs 只能以PLs 形式穿過血腦屏障,進而在大腦中參加各種生化反應(yīng)[17]。南極磷蝦油作為一種可替代魚油的新型海洋功能性油脂,不僅生物貯藏量大,同時還富含多種生物活性物質(zhì),如蝦青素、生育酚、維生素A 等,已成為近年來海洋脂質(zhì)的研究熱點[18-19]。雖然南極磷蝦油具有多種生理功效,但在食品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用仍受到一定限制,因此還需研究者進一步探索、改良與創(chuàng)新磷蝦油提取加工工藝,從而實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)品質(zhì)穩(wěn)定的磷蝦油。
表2 不同海洋生物脂肪酸概況Table 2 Fatty acid profile of different marine organisms
從海洋藻類中提取ω-3 PUFAs 以及通過基因工程培育產(chǎn)EPA 和DHA 的陸生植物同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)含有高純度EPA 和DHA的功能食品主要源自魚油,而魚類合成此類ω-3 PUFAs 的能力有限,需要通過捕食海洋藻類或蝦類來積累EPA 和DHA[20]。藻類作為海洋生態(tài)系統(tǒng)最主要的生產(chǎn)者,其體內(nèi)合成與積累的ω-3 PUFAs 會通過食物鏈傳遞并儲存于甲殼類、魚類、海洋哺乳類等海洋生物體內(nèi)[21]。并且由于藻類處于海洋生態(tài)系統(tǒng)的底層,故通過食物鏈逐級積累的脂溶性污染物在藻類中濃度通常最低,并且藻油中沒有魚油特有的魚腥味,制成的營養(yǎng)強化劑適合魚油過敏的亞健康人群食用[6,22]?,F(xiàn)如今,通過微藻技術(shù)可以大規(guī)模生產(chǎn)藻油,不僅藻油的產(chǎn)量較高,同時EPA 和DHA 的含量也高[20]?;诤Q笤孱惖母鞣N優(yōu)點確認以及EPA 和DHA 生物合成積累所需要基因的識別,研究者從微藻中選取特定基因,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)定向培育產(chǎn)EPA 和DHA的陸生植物[23]。據(jù)報道,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育出的茶花籽油中含有26%的EPA、大豆油中含有20%的EPA、芥菜油中含有15%的DHA[21]。然而,此項研究仍面臨許多困難和瓶頸亟待解決,例如:藻類基因合適載體的尋找,大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因作物的許可,“新型魚油”加工工藝改良與優(yōu)化。
ω-3 PUFAs 主要形式可分為乙酯(Ethyl esters,EEs)、游離脂肪酸(Free fatty acids,F(xiàn)FAs)、甘油三酯(Triacylglycerols,TAGs)和PLs 型。4 種不同結(jié)構(gòu)的ω-3 PUFAs 在體內(nèi)消化吸收差異如圖3所示。脂質(zhì)消化分解始于胃部,TAGs、PLs、FFAs、膽酸鹽(Bile salt,BS)、膽固醇(Cholesterol,CL)在胃的收縮下,不斷分散、重組進而乳化形成以TAGs 分子為疏水中心,周圍環(huán)繞一些FFAs、CL、兩親性PLs 分子的球形脂滴。在此過程中,胃脂酶可水解一部分的TAGs,生成甘油二酯(Diacylglycerols,DAGs)和FFAs[32]。研究表明,雖然在胃中只有10%~30%的TAGs 分解,但脂質(zhì)在胃中的預(yù)消化卻是人體代謝脂質(zhì)至關(guān)重要的一步。期間產(chǎn)生的FFAs 將有助于小腸內(nèi)脂質(zhì)的乳化,并且還能提高脂肪酶的活性[33]。當(dāng)各組分進入十二指腸后,脂質(zhì)組分在胃脂酶和胰腺酶的協(xié)同作用下開始最終的消化反應(yīng)[32-33]。胰脂酶是人體胰腺分泌的一種Sn-1,3 位特異性脂肪酶,能將TAGs 水解成2-甘油一酯(Monoacylglycerols,MAGs)和FFAs[32]。對于甘油骨架上Sn-1,3 位連有不同飽和度的脂肪酸,胰脂酶會展現(xiàn)出不同的水解效率。當(dāng)PUFAs連接在Sn-1 或Sn-3 位時,由于雙鍵靠近羧基形成空間位阻,胰脂酶的活性被降低,消化速率變慢[34]。故PUFAs 多位于Sn-1,3 的海豹、鯨魚等海洋哺乳類TAGs 的生物利用率,低于PUFAs 多位于Sn-2 位的魚類[35]。PLs 被磷脂酶分解為溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid,LPAs)和FFAs。EE 型ω-3 PUFAs 則被胰腺分泌的羧基酯脂肪酶(Carbonxylester lipase,CEL)分解,生成乙醇和FFAs,而產(chǎn)物乙醇不僅會增加肝臟的負擔(dān),而且對于乙醇不耐受人群可能會產(chǎn)生不良反應(yīng)。與EEs 相比,F(xiàn)FA 型ω-3 PUFAs 無需酶解就能被小腸上皮細胞直接吸收,故FFA 型ω-3 PUFAs 的生物利用率要高于EEs 型。
圖3 膳食脂類消化和吸收過程[32,45]Fig.3 The process of dietary lipid digestion and absorption[32,45]
TAGs、PLs、EEs 酶解后的各種產(chǎn)物在BS、CL的作用下,高度乳化形成混合微團,這將有助于各脂質(zhì)成分在含水腸腔內(nèi)溶解,供小腸上皮細胞吸收。在腸道不斷蠕動下,各脂質(zhì)分子通過小腸細胞質(zhì)膜的磷脂雙層被動擴散,或通過小腸細胞刷狀緣膜中特定蛋白質(zhì)的主動轉(zhuǎn)運吸收進入小腸上皮細胞[33]。2-MAG 在小腸上皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中利用甘油一酯?;D(zhuǎn)移酶(Monoacylglycerol acyltransferase,MGAT)與甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT) 重新酯化生成TAG;LPA 先由1-?;视?3-磷酸?;D(zhuǎn)移酶(1-Acyl-glycerol-3-phosphate acyltransferase,AGPAT)酰基化生成磷脂酸(Phosphatidic acid,PA),進而轉(zhuǎn)化為DAG,最終也酯化為TAG;CL 在?;o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferase,ACAT)催化下生生成膽固醇酯(Cholesterol esters,CE),并在微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白(Microsomal triglyceride transfer protein,MTP)的促進下,TAG 連接CE 和載酯蛋白B(Apolipoprotein B,ApoB)形成乳糜微粒,最終通過淋巴進入循環(huán)。
脂質(zhì)分子體內(nèi)代謝是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程,受多種因素影響,主要包括脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、人體代謝能力、食物的基質(zhì)效應(yīng)等,這些因素最終會導(dǎo)致ω-3 PUFAs 產(chǎn)生不同的生物利用率和臨床療效[36]。針對不同結(jié)構(gòu)的ω-3 PUFAs 研究者開展了一系列體內(nèi)實驗,按照實驗對象和周期可將研究分別劃分為人體、動物實驗和長期、短期實驗,如表3所示。大量實驗結(jié)果顯示,F(xiàn)FA 形式的ω-3 PUFAs 生物利用率最高,并且生物耐受性好,然而長期服用可能會引起常見的胃腸道副作用,如惡心、腹痛、腹瀉[37-40]。EE 型PUFAs 化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于FFAs 型,然而其在體內(nèi)充分的吸收依賴CEL 的輔助,尤其是在禁食或低脂肪攝入的情況下[41]。Beckermann 等[38]、Lawson 等[39]和Reis 等[42]都證實了EE 型PUFAs 在人體內(nèi)的生物利用率是最低的。此外,在24 名健康受試者的低脂肪膳食攝入下,通過分析24 h 內(nèi)血漿中EPA 和DHA 變化,Cuenoud 等[36]發(fā)現(xiàn)直接服用MAG 型PUFAs 的受試者對EPA 和DHA 的生物利用率顯著高于EE 型。此 結(jié) 論 與Chevalier 等[43]一 致,并 且Chevalier 在實驗中還發(fā)現(xiàn)女受試者對EE 型PUFAs 展現(xiàn)了更強的消化吸收能力。由表3中大鼠、人體的體內(nèi)實驗可知,TAGs 與PLs 的生物利用率高、低并無明確結(jié)論。主要是由于磷蝦油中PLs 含量會對其生物利用率產(chǎn)生較大影響。通常磷蝦油中PLs 的含量在19%~81%,當(dāng)以低含量PLs 的磷蝦油作為受試者的膳食補充劑,可能會導(dǎo)致PLs與TAGs 之間生物利用率的差異性減小,甚至消失[44]。研究者可先考慮選擇合適的分離純化方法提純磷蝦油中的PLs,在保證魚油和磷蝦油ω-3 PUFAs 相同或接近的前提下,以高純度的PLs 和TAGs 進行體內(nèi)實驗。
表3 不同結(jié)構(gòu)的ω-3 PUFAs 生物利用率Table 3 Bioavailability of ω-3 PUFAs with different structures
海洋生物中含有豐富的ω-3 PUFAs,尤其是EPA 和DHA。日常生活中通過膳食補充一定量的海產(chǎn)品將有益身體健康,然而由于多數(shù)海洋生物體內(nèi)ω-3 PUFAs 的含量普遍不高,想要通過膳食攝入從而達到對心腦血管疾病、炎癥、癌癥、老年癡呆癥等疾病的防治效果,往往需要補充大量的海產(chǎn)品。因此,優(yōu)化和創(chuàng)新制備高純度ω-3 PUFAs 的方法一直是現(xiàn)代食品、藥品領(lǐng)域中重要的研究課題。
低溫結(jié)晶法(Low temperature crystallization)富集ω-3 PUFAs 的原理是根據(jù)不同飽和度的脂肪酸在不同溫度和溶劑中溶解度的差異進行分離。隨著溫度降低,高熔點的SFAs 以及部分MUFAs 先結(jié)晶析出,而PUFAs 則保留在液相中。如表4所示,低溫結(jié)晶法不僅能有效富集FFA、TAG 型EPA 和DHA,而且對MAG 型PUFAs 的提純也具有一定效果。正己烷、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇等都是低溫結(jié)晶法常用的溶劑,然而對于富集不同類型的脂肪酸,各溶劑展現(xiàn)出較大差異[29,49]。Zhang 等[50]采用低溫結(jié)晶法富集FFA 型PUFAs時,結(jié)果顯示乙腈的富集效果最佳,當(dāng)2 組試驗于最優(yōu)條件下進行,EPA 和DHA 總純度分別上升了35.2%和18.5%。相較于單鏈脂肪酸,甘油骨架上連有3 個脂肪酸的TAGs 極性較小。因此,當(dāng)TAGs 與甲醇、乙腈等極性較大的溶劑混溶時,難以形成均勻的混合層。在前人的研究中,丙酮不僅對TAGs 有較強的溶解能力,而且還具有較低熔點、低黏度等優(yōu)點,是富集植物油中TAG 型ω-3 PUFAs 的理想溶劑[51]。Mu 等[49]采用低溫結(jié)晶法富集藻油中的DHA,在最優(yōu)反應(yīng)條件下,丙酮作為低溫結(jié)晶溶劑,油溶質(zhì)量比為1∶8,結(jié)晶溫度-80℃,結(jié)晶時間4 h,DHA 含量達到了53.87%,得率為62.46%。對比表4中不同脂肪酸類型的裂壺藻、長尾鱈富集后EPA、DHA 增量可知,富集TAG型EPA、DHA 的難度大于FFA 型。原因在于原料魚油或藻油的TAGs 分子連接的3 個脂肪酸飽和程度可能不同,并且低溫結(jié)晶法并不能改變TAG分子結(jié)構(gòu)。因此在富集EPA 和DHA 時,TAGs 甘油骨架上會保留一部分SFAs 或MUFAs。
表4 低溫結(jié)晶法富集不同結(jié)構(gòu)的EPA 和DHATable 4 Enrichment of EPA and DHA with different structures by low temperature crystallization
低溫結(jié)晶法有操作簡便,對設(shè)備要求低,有效成分不易變性等優(yōu)點,常用于ω-3 PUFAs 初步富集。然而此法需要使用大量的有機試劑,可能存在溶劑殘留的問題,而且目標產(chǎn)物的分離效率與得率都較低,因此難以實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
尿素晶體是直徑為5.5~5.8 ? 的六面體結(jié)構(gòu),碳原子數(shù)目大于6 個的線性脂肪酸能與尿素形成穩(wěn)定的包合物,在低溫下結(jié)晶析出[56]。而如EPA、DPA、DHA 等脂肪酸中含有多個雙鍵,導(dǎo)致其碳鏈彎曲,線性變差,難以與尿素形成穩(wěn)定的包合物,基于此原理尿包法能有效富集分離魚油或海豹油中的ω-3 PUFAs。對于包合物的形成,常用甲醇或乙醇來提高尿素與脂肪酸的接觸。研究發(fā)現(xiàn),采用尿包法富集PUFAs 時,甲醇或乙醇可能會與尿素反應(yīng),產(chǎn)生有遺傳毒性且潛在致癌的氨基甲酸甲酯 (Methyl carbamate,MC) 或氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)[57]。Vazquez 等[57]對比不同的環(huán)境和反應(yīng)條件下,以尿包法富集向日葵油、藍薊油、魚油中PUFAs 后,非尿包相(Non-urea complexation fraction,NUCF) 中EC 的含量。結(jié)果表明,在高溫和室溫環(huán)境下,3 種油脂的NUCF 中都檢測到了EC,其中各組在高溫環(huán)境下EC 的含量均高于室溫,尤其是在魚油組中兩者之間差距達到了近17 倍。然而,研究者發(fā)現(xiàn)通過40%(體積分數(shù))酸性水(含1%H2SO4)和40%(體積分數(shù))蒸餾水2 次清洗后,各組NUCF 中EC 均未被檢出。由此可見,充分水洗不僅可以去除尿素和其它極性物質(zhì),還有助于除去EC。因此,以尿包法富集的EPA 和DHA 等ω-3 PUFAs 作為動物實驗的口服試劑時,為防止高含量EC 對動物體質(zhì)造成潛在影響,研究者應(yīng)對尿包后的產(chǎn)物進行充分的清洗[58]。
如表5所示,尿脂比、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時間是尿包法最主要的試驗參數(shù),研究者通過優(yōu)化上述反應(yīng)條件從而獲得高含量ω-3 PUFAs。通常富集后ω-3 PUFAs 的純度在60%~80%,具體差距因原料和反應(yīng)條件而異。雖然,尿包法只能分離飽和或部分單不飽和的單鏈脂肪酸,并且難以將長碳鏈、高不飽和度的PUFAs 進一步分離,然而由于其工藝成熟,反應(yīng)條件溫和,操作簡單,生產(chǎn)成本低等優(yōu)點,現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于ω-3 PUFAs 的初步富集。
表5 尿素包合法富集ω-3 PUFAsTable 5 Enrichment of ω-3 PUFAs by urea complexation
分子蒸餾(Molecular distillation)又稱短程蒸餾(Short-path distillation),是一種在高真空下利用不同物質(zhì)分子平均自由程差異進行液液分離的技術(shù),由于其操作溫度低、真空度高、受熱時間短,特別適合分離黏度大、沸點高、熱敏性物質(zhì)[63]。分子蒸餾原理如圖4所示,在一定溫度和真空度下,由于混合液中SFA 和MUFA 自由程較小,可以到達冷凝管從輕相凝結(jié)而出,而EPA、DPA、DHA 自由程較大,則會沿著加熱板從重相流出。張紅燕等[64]探究了多級分子蒸餾對脂肪酸富集效果的影響,結(jié)果表明隨著分子蒸餾級數(shù)的上升,EPA 和DHA 的富集效果呈先上升后下降的趨勢,其中二級分子蒸餾效果最佳,EPA 和DHA 總含量達到了84.26%。分子蒸餾不僅可以實現(xiàn)對EPA 和DHA的有效富集,而且在粗魚油精制過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,粗魚油經(jīng)過分子蒸餾處理后,酸值、過氧化值、茴香胺值以及非皂化物含量均顯著減小[65]。然而,分子蒸餾并不能完全取代魚油的精制,因為粗魚油經(jīng)分子蒸餾后可能還存在大量的非皂化物、色素和重金屬,此時的魚油還需進一步脫膠和脫色,使其各項理化指標達到水產(chǎn)行業(yè)標準。此外,為進一步提高產(chǎn)物中EPA 和DHA 的含量,研究者通常將分子蒸餾與尿包法結(jié)合。Lin 等[60]通過聯(lián)合尿包法與分子蒸餾法,并利用響應(yīng)面法優(yōu)化反應(yīng)條件,最終將EPA 和DHA 的含量由30%提升至83.6%。分子蒸餾法還可以將酶法反應(yīng)后的混合產(chǎn)物中甘油酯型ω-3 PUFAs 進一步純化,Li 等[66]利用兩步酶法富集得到TAG 和EE 混合產(chǎn)物,在140 ℃下分子蒸餾,重相中TAG 的純度達到了98.75%,其中甘油酯型ω-3 PUFAs 達到了88.44%。
圖4 分子蒸餾原理示意圖[63]Fig.4 Schematic diagram of molecular distillation principle[63]
分子蒸餾法設(shè)備簡單,操作溫度低,自動化程度高,分離過程綠色環(huán)保且無毒害氣體排放。然而,分子蒸餾法并不能用于富集TAGs 或PLs 型ω-3 PUFAs,并且對EEs 型EPA 和DHA 進一步分離還存在較大難度。因此,為獲得高純度EPA、DPA、DHA 單體還需要將分子蒸餾與其它分離純化方法結(jié)合。
脂肪酶法制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì) (Structured lipids,SLs)是近些年的研究熱點,其催化反應(yīng)原理是基于脂肪酶對甘油酯位置和脂肪酸?;x擇性的差異,主要分為3 種方法:水解法、酯化法、酯交換法。富集高含量ω-3 SLs 的首要條件是選擇合適的脂肪酶。如表6所示,Lipozyme RM IM、Novozym 435、Lipozyme 435 和Lipozyme TL IM都是較為成熟的固定化酶,廣泛應(yīng)用于富集SLs,其中Novozym 435 是學(xué)術(shù)界和工業(yè)界使用最廣泛的商業(yè)脂肪酶[67]。Wang 等[68]發(fā)現(xiàn)一種源于海洋鏈霉菌屬菌株W007 的熱穩(wěn)定脂肪酶(MAS1),以樹脂XAD1180 作為固定化MAS1 酶的載體,并比較了固定化MAS1 酶與Novozym 435 酶的催化效率。結(jié)果顯示,固定化MAS1 酶的酯化率與TAGs合成率均高于Novozym 435。此后,研究者以同種固定化酶催化EEs 與磷脂酰膽堿酯化,在最優(yōu)條件下,ω-3 PUFAs 結(jié)合率為43.55%[69]。如表6所示,上述3 種酶法富集后的產(chǎn)物均為混合物,通常需要采用多步酶法或聯(lián)合其它方法如分子蒸餾法、液-液溶劑提取法,進一步分離出高純度的目標產(chǎn)物。He 等[70]先以Lipozyme TL IM 酶催化醇解TAGs 得到EEs、甘油酯混合物,隨后以150 ℃的分子蒸餾將EEs 與甘油酯分離,最終得到甘油酯型DPA 和DHA 分別為17.9%和70.3%。而分子蒸餾法難以將MAGs、DAGs、TAGS 完全分離,過高蒸餾溫度會使油脂發(fā)生碳化。Zhang 等[55]醇解金槍魚油后得EEs 和甘油酯混合物,將其先后溶于10 mL 正己烷和10 mL 85%乙醇溶液中,由于極性的差異MAG 會富集在含水的乙醇層,經(jīng)過3 次提取,2-MAG 含量在94%以上。
表6 酶法富集結(jié)構(gòu)脂質(zhì)Table 6 Enzymatic enrichment of structural lipids
與傳統(tǒng)方法相比,脂肪酶法反應(yīng)條件溫和,選擇性高,可富集更易被人體吸收的甘油酯型或磷脂型EPA 和DHA,而此法存在脂肪酶種類少,易失活,反應(yīng)產(chǎn)物難以分離等問題,未來還需研究者進一步探索和總結(jié)。
色譜法是分離天然產(chǎn)物中高純單體或同分異構(gòu)體中廣泛使用的方法,其分離原理是基于各組分在固定相和流動相之間的分配差異。如表7所示,色譜法在分離EPA-EE 和DHA-EE 高純單體的試驗中效果顯著。Oh 等[73]先以固定相為C18 的半制備型高效液相色譜(High performance liquid chromatographyliquid,HPLC)分離純化DHA,選擇甲醇∶水(體積比96∶4)作為流動相,分離出純度為98.5%的DHA-EE。隨后逐步放大至進樣量為1 200 mg 的制備型HPLC,最終得到DHA-EE 的純度和得率分別為99.0%和79.8%。由于EPA 或DHA 存在多個雙鍵,易與銀離子形成可逆的極性絡(luò)合物,因而銀離子硅膠色譜可用于分離脂肪酸甲酯或乙酯。然而,由于銀離子與硅膠表面的靜電作用力較弱,易被流動相中極性溶劑洗脫至樣品中,從而導(dǎo)致樣品受污染、實驗重現(xiàn)性降低并且可能導(dǎo)致分析型檢測器出現(xiàn)問題,故此項技術(shù)仍停留在實驗室階段。研究表明,將銀離子固載于疏丙基硅膠上,同時選擇低極性的流動相,會極大提高銀離子在固定相上的穩(wěn)定性[74]。Dillon 等[74]選用以AgTCM 為固定相,正庚烷∶丙酮(體積比95∶5)為流動相的HPLC,5~10 min 就可分離出純度均超過95%的EPA 和DHA。
表7 色譜法制備高純度EPA-EE 或DHA-EETable 7 Preparation of high purity EPA-EE or DHA-EE by chromatography
高速逆流色譜 (High-Speed countercurrent chromatography,HSCCC)作為一種新型的液-液分配色譜,無需固態(tài)載體,因此有效避免了分離組分被固定相不可逆吸附。吳兵兵[75]報道了以HSCCC從裂壺藻中分離純化DHA 的工藝,通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗參數(shù),在最優(yōu)條件下,分兩步純化,得到純度超過99%的DHA。近年來,模擬移動床(Simulated moving bed,SMB)色譜開始運用于脂肪酸的分離純化。研究表明,SMB 色譜不僅可以實現(xiàn)EPA 和DHA 高效分離,而且有效避免流動相溶劑的大量使用。Wei 等[76]利用三區(qū)域SMB 工藝,將原料中純度為50.9%的EPA 和39.8%的DHA 分別提升至97.6%和94.5%。Li 等[77]串聯(lián)8根C18 柱(10 μm,120 ?)形成SBM 系統(tǒng),以純甲醇為流動相,最終將EPA 和DHA 的相對純度提升超過99%。然而,無論是銀離子正相色譜、HPLC、HSCCC,還是SMB 色譜都存在使用一種或多種有機溶劑的情況。作為兼顧氣相色譜和液相色譜優(yōu)點的超臨界流體色譜 (Supercritical fluid chromatography,SFC),通常是以CO2作為流動相,在提純分離EPA 和DHA 過程中減少甚至消除了有機溶劑的使用。Montanes 等[78]采用一步式SFC提純分離藻油和魚油中的EPA 和DHA,并探究壓力、溫度、進樣量、助溶劑、CO2流速、色譜柱對純化效果的影響。結(jié)果顯示,色譜柱填料粒徑是影響試驗結(jié)果最顯著的參數(shù),并且在最優(yōu)條件下,藻油和魚油中EPA 的純度都超過95%。由此可見,SFC不僅可以富集出高純度EPA 或DHA,而且其工藝條件溫和且環(huán)保,因此在未來制備高純度的ω-3 PUFAs 方面擁有廣闊的應(yīng)用空間。
上述色譜方法均可以分離純化出高純度EPA-EE 或DHA-EE,然而對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜且含有大量同分異構(gòu)體的TAG 或PL 卻難以實現(xiàn)有效分離。色譜法聯(lián)用質(zhì)譜或核磁共振是檢測與鑒定TAG 或PL 結(jié)構(gòu)常用的方法,未來研究者可以探索基于液質(zhì)聯(lián)用或核磁共振,對已知結(jié)構(gòu)富含ω-3 PUFAs 的TAG 或PL 色譜分離的方法。
ω-3 PUFAs 具有多種生理功效,廣泛應(yīng)用于炎癥、癌癥、心血管疾病以及糖尿病預(yù)防方面,并且對視覺系統(tǒng)發(fā)育和大腦機能的提升效果顯著。海洋生物含有豐富的ω-3 PUFAs,是人類膳食補充最主要的來源。海洋藻類養(yǎng)殖受季節(jié)因素影響小、藻油中ω-3 PUFAs 含量高并且無不良氣味,逐漸替代魚油作為膳食補充劑、營養(yǎng)強化劑和嬰幼兒配方食品。南極磷蝦油生物貯藏量大,含有PL 型ω-3 PUFAs、蝦青素、脂溶性維生素等多種有益成分,如今已成為海洋功能性脂質(zhì)的研究熱點。探究不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的ω-3 PUFAs 在人體內(nèi)代謝差異,對海洋功能食品的研究與開發(fā)意義深遠。然而,現(xiàn)階段各種體內(nèi)代謝研究還存在諸多缺陷亟待解決。例如:在未來研究中各試驗組提供的EPA 和DHA 劑量應(yīng)保持一致,順式和反式的EPA和DHA 代謝差異性還需繼續(xù)探索,受試者基數(shù)和檢測指標應(yīng)進一步增加。
現(xiàn)如今,提純分離EE 型ω-3 PUFAs 的技術(shù)已經(jīng)很成熟,聯(lián)合多種方法即可得到純度大于99%的EPA 或DHA,其中符合綠色環(huán)保理念的SFC 是未來大規(guī)模生產(chǎn)高純ω-3 PUFAs 的理想技術(shù)。然而,對于富集擁有復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的TAG或PL 型ω-3 PUFAs 仍面臨許多困難和瓶頸。傳統(tǒng)方法如尿素包合法、分子蒸餾法等都無法達到富集的目的;低溫結(jié)晶法往往需要使用大量有機試劑,而且富集分離后EPA 和DHA 的含量和產(chǎn)量都較低;酶法作為一種高效富集SLs 的方法,反應(yīng)條件溫和,選擇性強,具有廣闊的應(yīng)用前景。然而酶法面臨脂肪酶易失活,種類單一,反應(yīng)后產(chǎn)物難以分離等問題。在未來研究者需將酶法與其它脂肪酸分離純化的方法結(jié)合起來,在此基礎(chǔ)上開發(fā)綠色溶劑、探索新型酶源以及優(yōu)化各步驟試驗參數(shù),以期獲得高純度的TAG 或PL 型ω-3 PUFAs。