戴志偉，孔令明，劉 偉，張 玥，楊 罡，伊力夏提·艾熱提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 烏魯木齊 830000）

西梅（Prunus domestica），是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）果樹果實(shí)[1]。西梅以獨(dú)特的外形和口感、不含膽固醇和脂肪的特性[2]，富含抗氧化物質(zhì)[3]和骨骼健康的相關(guān)物質(zhì)[4]而獲得“奇跡水果”的美稱。其中，新疆有野生種西梅的分布[5]，是西梅的發(fā)源地之一。

蔬菜和水果的內(nèi)部或表皮上的微生物、當(dāng)?shù)丨h(huán)境，共同形成一個互生或共生的系統(tǒng)，該系統(tǒng)相對穩(wěn)定，而不同地域環(huán)境的微生物種群也不同[6]，其中的乳酸菌是這個系統(tǒng)中微生物區(qū)系的一小部分[6-7]，甚至是系統(tǒng)的優(yōu)勢菌。一般來說，從果蔬中分離出的本地乳酸菌，在適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的同時也適應(yīng)植物的基質(zhì)，相比于商業(yè)乳酸菌更適應(yīng)以果蔬為發(fā)酵基質(zhì)的不利條件，從而保留果蔬的感官品質(zhì)及其活性成分。

Raffaella 等[6]在Nancy 等[8]的基礎(chǔ)上對自源乳酸菌發(fā)酵果蔬進(jìn)行研究，直投式發(fā)酵劑在一定程度上不能完全適應(yīng)某種果蔬底物，大多需要訓(xùn)化，為得到較理想的發(fā)酵終產(chǎn)物，所選菌種必須適應(yīng)原料的內(nèi)在特性[9]。研究發(fā)現(xiàn)：本地自源乳酸菌在發(fā)酵當(dāng)?shù)靥}卜、菜豆等蔬菜時，在色澤、保存期等方面均有一定優(yōu)勢，同時利用本地自源乳酸菌發(fā)酵紅辣椒和黃辣椒結(jié)合一些其它處理，可以最大程度地保護(hù)色澤，延長貨架期[10]。在利用乳酸菌發(fā)酵櫻桃泥的過程中，本地乳酸菌對黏度、抗氧化等也有一定的正向影響[11]。在最小加工的前提下，本地乳酸菌可以最大程度地保證菠蘿的抗氧化活性和硬度，同時最大程度地保存菠蘿的天然顏色和氣味[12]。雖然本地乳酸菌在一定程度上優(yōu)于商業(yè)發(fā)酵菌種，但并不是所用本地菌種都有預(yù)期的發(fā)酵效果。

本文以新疆喀什縣的“女神”西梅為原料，采用溴甲酚紫MRS 培養(yǎng)基和改良的西梅汁MRS 培養(yǎng)基，從“女神”西梅原漿樣品中篩選、鑒定產(chǎn)酸性好，適合西梅發(fā)酵的乳酸菌株，從產(chǎn)酸性能及抗氧化性能方面評估5 株乳酸菌，通過pH 值、總酸、總酚含量等指標(biāo)對比它們發(fā)酵西梅漿的性能，為篩選優(yōu)良的果蔬發(fā)酵專用菌種，豐富菌種庫，為開發(fā)新型西梅深加工產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 新疆“女神”西梅，新疆喀什地區(qū)伽師縣。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS 培養(yǎng)基、MRS 肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；溴甲酚紫MRS 培養(yǎng)基[13]：在MRS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加溴甲酚紫0.4 g/L；西梅汁培養(yǎng)基[14]：無菌水900 mL、西梅汁100 mL、葡萄糖22 g/L、乙酸鈉5 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、瓊脂15 g/L。

1.1.3 試劑 HBI 乳酸菌生化鑒定條（GB），海博生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸），上海源葉生物科技有限公司；其它試劑，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-1200 紫外分光光度計(jì)，北京普析通用有限責(zé)任公司；AIPHAPPHOT-2 YS2 光學(xué)顯微鏡，日本Nikon 公司；DHP-9162 微生物恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌富集和分離篩選 取適量新疆 “女神”西梅原漿接入液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)對菌種進(jìn)行富集。

蘸取富集液在溴甲酚紫MRS 固體培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)36 h，挑取周圍黃色面積較大的菌落進(jìn)行純化。通過革蘭氏染色及酶觸試驗(yàn)初篩符合條件的乳酸菌株。將初篩菌株接入西梅汁培養(yǎng)基中，選擇生長較好的乳酸菌接入MRS 斜面培養(yǎng)基中，4 ℃低溫保藏。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

1.3.2.1 生理、生化鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)[15]和[16]對分離的菌株進(jìn)行碳源消耗試驗(yàn)及明膠液化、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)等，對篩選出的菌株進(jìn)行生理、生化綜合評定。

1.3.2.2 16S rDNA 分子鑒定 將最終篩選的目標(biāo)菌株送至上海生工生物工程有限公司測定16S rDNA 序列。

1.3.3 5株自源乳酸菌生長曲線及產(chǎn)酸性能測定

1.3.3.1 乳酸菌生長曲線 以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量將活化的菌種接入250 mL MRS 肉湯中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h 測定其OD600nm，用同樣處理的空白MRS 肉湯調(diào)零，繪制5 株菌種的生長曲線。

1.3.3.2 乳酸菌pH 值的測定 用PHS-3C 型pH計(jì)測定。

1.3.3.3 乳酸菌總酸含量的測定 參考GB/T 12456-2008[17]測定。

1.3.4 5株自源乳酸菌抗氧化性的測定

1.3.4.1 細(xì)胞提取 完整乳酸菌細(xì)胞懸液（Intact cell，IC）[18-19]的制備：將5 株活化兩代后的菌種接入MRS 肉湯中恒溫培養(yǎng)36 h，4 ℃，6 000 r/min 低溫離心10 min，取菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液（pH 7～7.3）清洗2～3 遍后，配成菌懸液（1.0×108CFU/mL）。

無細(xì)胞提取液（Cell-free Extract，CFE）[18-19]的制備：取配制的5 株完整細(xì)胞菌懸液，超聲冰浴破碎至在顯微鏡下無完整細(xì)胞，10 000 r/min 低溫離心20 min，取上清液。

1.3.4.2 菌株DPPH 自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[20]，根據(jù)本試驗(yàn)樣品特性略作修改。取5株乳酸菌的完整細(xì)胞懸液和無細(xì)胞提取液各2 mL，加入新配制的0.2 mmol/L DPPH 溶液2 mL（將吸光度調(diào)節(jié)至1.2～1.3），避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm 處測定吸光值。根據(jù)公式 （1） 計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中，A1——樣品組，完整細(xì)胞液/無細(xì)胞提取物與DPPH 溶液混合時的吸光度；A2——空白組，完整細(xì)胞液/無細(xì)胞提取物與2 mL 無水乙醇溶液的吸光度；A3——對照組，為2 mL DPPH 溶液與2 mL 無水乙醇的吸光度。

1.3.4.3 菌株ABTS 自由基清除率的測定 參考文獻(xiàn)[21]，根據(jù)本試驗(yàn)樣品特性略作修改。取完整細(xì)胞液/無細(xì)胞提取物0.2 mL 與ABTS 工作液4 mL 充分混合，在室溫避光條件下靜置30 min，在波長734 nm 處測定吸光值。根據(jù)公式（2）計(jì)算ABTS 自由基清除率。

式中，A1——空白組，磷酸鹽緩沖液與ABTS工作液混合的吸光度；A2——樣品組，完整細(xì)胞液/無細(xì)胞提取物與ABTS 工作液混合的吸光度。

1.3.4.4 菌株還原力的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[22]并如下修改：在5 個完整細(xì)胞液/無細(xì)胞提取物樣品中分別加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的K3[Fe（CN）6]，2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），振蕩均勻后50 ℃水浴20 min，4 ℃冰水冷卻5 min，冷卻后分別加入2.5 mL 10%TCA 溶液，3 500 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，逐次加入蒸餾水2.5 mL，0.1%FeCl3溶液0.5 mL，室溫靜置10 min 后測定吸光值（OD700nm）。吸光值代表還原能力，吸光值越高還原力越強(qiáng)。

1.3.5 篩選乳酸菌發(fā)酵西梅漿過程中漿液抗氧化性的測定

1.3.5.1 西梅漿的制備及發(fā)酵 挑選新鮮西梅漂洗、瀝干，去核。按西梅與水質(zhì)量比1∶1 打漿。為給菌種提供適宜的發(fā)酵環(huán)境，用NaHCO3將西梅漿pH 值調(diào)至4.50～5.00 范圍，用蔗糖將西梅漿的糖度調(diào)節(jié)至12°Brix。為使殺菌徹底，將西梅漿煮沸3～5 min 滅菌、滅酶，冷卻后分別以5%的接種量（體積分?jǐn)?shù)）接種乳酸菌，以未接種的西梅漿為空白對照。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵96 h，每24 h 取樣1 次并測定。

1.3.5.2 發(fā)酵西梅漿總酚含量的測定 采用福林-酚比色法[23]測定，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 （y=0.6289x+0.0192，R2=0.9979）。每1 mL 西梅漿發(fā)酵液中總多酚含量以沒食子酸記，單位為mg/L。

1.3.5.3 發(fā)酵西梅漿DPPH 自由基清除能力的測定 將1.3.4.1 節(jié)樣品換為離心后的西梅漿上清液。

1.3.5.4 發(fā)酵西梅漿ABTS 自由基清除率的測定將1.3.4.2 節(jié)樣品換為離心后的西梅漿上清液，空白組用蒸餾水和樣品混合。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌初篩結(jié)果與分離純化

通過溴甲酚紫MRS 固體培養(yǎng)基對富集液中的乳酸菌進(jìn)行初篩。挑取黃色圈較大的菌株多次劃線純化，經(jīng)革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)，8 株菌為革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，初步確定為乳酸菌。將這8 株乳酸菌接入西梅汁固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培育24 h，其中3 株菌未生長，5 株菌（E2、C2、D2、M2、P1）生長良好。

2.2 乳酸菌生理、生化鑒定結(jié)果

5 株乳酸菌的部分生理、生化試驗(yàn)及糖類發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。由表1可知，5 株菌的過氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)均為陰性。糖類發(fā)酵試驗(yàn)表明，5 株菌均能利用七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖等碳水化合物。除E2 外，均能利用甘露醇。

表1 5 株自源乳酸菌的生理、生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of 5 self-sourced lactic acid bacteria

表2 5 株自源乳酸菌的碳源發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Carbon source fermentation test results of 5 self-sourced lactic acid bacteria

2.3 菌株的16S rDNA 鑒定結(jié)果

將5 株菌進(jìn)行16S rDNA 測序，將測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 同源性比對，將菌株序列同源性高于99%的幾株菌株進(jìn)行BLAST 分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。通過分析結(jié)果，可確定E2 為腸膜明串珠菌 （Leuconostoc mesenteroides），C2、D2、M2、P1 為屎腸球菌（Enterococcus Faecium）。

圖1 基于16S rDNA 序列5 株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 5 kinds of lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequence

2.4 5 株自源乳酸菌的生長曲線及產(chǎn)酸性能

2.4.1 在MRS 肉湯中的生長曲線 5 株自源乳酸菌在MRS 肉湯中的生長曲線如圖2所示。屎腸球菌C2、D2、M2、P1 生長趨勢大體相似，無明顯滯后期，對數(shù)生長期內(nèi)菌體數(shù)量增長平穩(wěn)，25～38 h 逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，其中，屎腸球菌P1 在穩(wěn)定期菌體含量高于其它3 株屎腸球菌。腸膜明串珠菌E2 有2～3 h 的滯后期以適應(yīng)生長環(huán)境，5 h 后迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，增長速率顯著高于其它4 株屎腸球菌，15 h 時進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵30 h 仍保持較高的菌體含量且高于其它4 株屎腸球菌。

圖2 5 種乳酸菌在MRS 肉湯中的生長曲線Fig.2 Growth curve of 5 kinds of lactic acid bacteria in MRS broth

2.4.2 在MRS 肉湯中的產(chǎn)酸性能 發(fā)酵液中的pH 值和總酸含量可以很好地反映菌株的產(chǎn)酸性能，其中pH 值下降速率反映菌株對發(fā)酵基質(zhì)的利用情況[13]，發(fā)酵終點(diǎn)pH 間接反映菌株的耐酸性。如圖3和圖4所示，發(fā)酵液和產(chǎn)酸量的變化趨勢相似，5 株菌的發(fā)酵液在0～20 h 內(nèi)處于對數(shù)生長期，pH 值逐漸下降，總酸含量逐漸上升。20 h 后處于穩(wěn)定期，pH 值趨于平緩，總酸含量上升幅度減緩。相比4 株屎腸球菌，腸膜明串珠菌E2 在MRS肉湯中有更好的產(chǎn)酸性能，40 h 左右將發(fā)酵液的pH 值降至4.29，總酸含量升至13.15 g/L，說明利用腸膜明串珠菌E2 接種發(fā)酵，可使體系快速酸化，將體系pH 值降至較低水平。

圖3 5 種乳酸菌在MRS 肉湯中pH 值的變化Fig.3 The changes of pH value of 5 kinds of lactic acid bacteria in MRS broth

圖4 5 種乳酸菌在MRS 肉湯中產(chǎn)酸量的變化Fig.4 Changes in acid production of 5 kinds of lactic acid bacteria in MRS broth

2.5 乳酸菌的抗氧化能力

如圖5所示，5 株乳酸菌的IC 組與CFE 組均具有一定的DPPH 自由基清除能力。4 株屎腸球菌的IC 組的DPPH 自由基清除率低于已報(bào)道的部分屎腸球菌菌株[19，24]。腸膜明串珠菌E2 的IC 組和CFE 組的DPPH 自由基清除率均遠(yuǎn)高于屎腸球菌（P＜0.05），說明腸膜明串珠菌E2 有較好的DPPH 自由基清除率能力。5 株乳酸菌的IC 組的DPPH 清除率均高于CFE 組，說明清除DPPH 自由基的活性物質(zhì)主要存在于它們活細(xì)胞的表面，與張香美等[19]、夏海燕等[25]的研究結(jié)果一致。

圖5 5 株自源乳酸菌菌懸液及無細(xì)胞提取物對DPPH 自由基的清除率Fig.5 The scavenging rate of DPPH free radicals by 5 strains of self-sourced lactic acid bacteria intact cell and cell-free extracts

如圖6所示，腸膜明串珠菌E2 和屎腸球菌C2、M2、P1 的IC 組ABTS 自由基清除率高于CFE組，說明這4 株乳酸菌清除ABTS 自由基的活性物主要存在于菌體表面和代謝物中，其中E2、C2和M2 的IC 組有相對較好的ABTS 自由基清除能力。屎腸球菌D2 的CFE 組的ABTS 清除率高于IC 組，與其它3 株屎腸球菌相反，說明菌株清除ABTS 自由基的活性物質(zhì)的部位在同屬菌種中也有一定差異[26]。

圖6 5 株自源乳酸菌菌懸液及無細(xì)胞提取物對ABTS 自由基的清除率Fig.6 The scavenging rate of ABTS free radicals by 5 strains of self-sourced lactic acid bacteria intact cell and cell-free extracts

乳酸菌的還原性能力也是衡量其抗氧化活性的指標(biāo)之一[27]。由圖7可知，5 株乳酸菌的IC 組和CFE 組均表現(xiàn)出一定的還原能力，5 株菌IC 組的還原能力差異性較小，腸膜明串珠菌E2 的IC 組還原能力較強(qiáng)，5 株菌IC 組的還原能力均顯著高于CFE 組，說明5 株乳酸菌具有還原能力的活性物質(zhì)均分布在細(xì)胞表面或代謝物中，胞內(nèi)分布較少。

圖7 5 株自源乳酸菌菌懸液及無細(xì)胞提取物的還原能力Fig.7 Reducing ability of 5 self-sourced lactic acid bacteria intact cell and cell-free extracts

2.6 乳酸菌發(fā)酵西梅漿的抗氧化活性

相關(guān)研究[28-29]表明，植物組織中的酚類物質(zhì)通過氫原子轉(zhuǎn)移或單原子傳遞螯合金屬離子清除自由基達(dá)到抗氧化效果。西梅汁中酚類物質(zhì)含量豐富，發(fā)酵過程中西梅漿中酚類物質(zhì)為主要抗氧化成分。乳酸菌發(fā)酵過程中通過自身繁殖代謝起到輔助抗氧化或維持抗氧化活性的作用。綜上所述，乳酸菌發(fā)酵過程中的抗氧化能力是由果蔬中酚類物質(zhì)與菌種自身決定。

如圖8所示，對照組和發(fā)酵組總酚含量均呈下降趨勢，相較于對照組，5 個發(fā)酵組的總酚含量24 h 后下降幅度趨于平緩，且在發(fā)酵終點(diǎn)（96 h）的總酚含量均高于對照組，其中腸膜明串珠菌E2發(fā)酵西梅漿在96 h 時總酚含量最高 （583.16 mg/L），屎腸球菌C2 次之（568.89 mg/L）。

圖8 不同自源乳酸菌在發(fā)酵西梅漿過程中總酚含量的變化Fig.8 The changes in the total phenol content of prunes pulp during fermentation of different self-sourced lactic acid bacteria

如圖9、圖10所示，對照組和發(fā)酵組的DPPH自由基清除率和ABTS 自由基清除率均呈下降趨勢，腸膜明串珠菌E2 的DPPH 自由基清除率下降速率較為平緩，發(fā)酵96 h 時的DPPH 自由基清除率遠(yuǎn)高于其余4 個發(fā)酵組。對照組及屎腸球菌D2、M2、P1 發(fā)酵組的ABTS 自由基清除率在發(fā)酵48 h 后快速下降，腸膜明串珠菌E2 及屎腸球菌C2 發(fā)酵48 h 后ABTS 自由基的清除率下降較為平緩，且在發(fā)酵終點(diǎn)（96 h）的ABTS 自由基清除率高于其它組。

圖9 不同自源乳酸菌發(fā)酵西梅漿過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.9 The changes in scavenging DPPH radical of prunes pulp during fermentation of different self-sourced lactic acid bacteria

圖10 不同自源乳酸菌發(fā)酵西梅漿過程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.10 The changes in scavenging ABTS radical of prunes pulp during fermentation of different self-sourced lactic acid bacteria

通過對比，腸膜明串珠菌E2 和屎腸球菌C2在發(fā)酵西梅汁過程中保持較高的抗氧化活性，推斷這2 株更適合西梅漿發(fā)酵。

3 結(jié)論

1）從新疆“女神”西梅原漿中篩選出5 株產(chǎn)酸性能較好且在西梅汁培養(yǎng)基中生長較好的乳酸菌，經(jīng)生理、生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，確定E2為腸膜明串珠菌，C2、D2、M2、P1 為屎腸球菌。

2）腸膜明串珠菌E2 在MRS 肉湯中生長迅速且產(chǎn)酸性能較好，經(jīng)綜合比對，腸膜明串珠菌E2 和屎腸球菌C2 的完整乳酸菌細(xì)胞懸液有較好的抗氧化能力。

3）發(fā)酵西梅漿過程中，腸膜明串珠菌E2 和屎腸球菌C2 發(fā)酵組的總酚含量較高，抗氧化能力較為突出，適合西梅漿的發(fā)酵。