劉麗麗 李建輝 劉汝明 陳 駿 鄭雪良 楊海英 王登亮 孫建城

（1衢州市農業(yè)林業(yè)科學研究院果樹研究所，浙江衢州 324000；2衢州學院化學與材料工程學院，浙江衢州 324000；3衢州市柯城區(qū)林業(yè)技術推廣中心，浙江衢州 324000）

薄殼山核桃（Carya illinoensis）為胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya）特色堅果和木本油料樹種，別名薄皮山核桃、碧根果、長山核桃、美國山核桃，原產地為美國密西西比河流域[1-2]。薄殼山核桃種仁不飽和脂肪酸含量較高，具有降低膽固醇等保健作用[3]，同時還富含脂肪、蛋白質、VE、氨基酸及多種微量元素，食味香醇可口，含油率最高可達80%。因此，薄殼山核桃營養(yǎng)價值和經濟價值較高，行業(yè)發(fā)展前景廣闊。

根際微生物作為土壤與植物相互作用的重要媒介，其生長受到土壤和植物的雙重作用與影響。植物根系通過向根際釋放各種分泌物，吸引各類微生物在根際定殖，并影響其群落結構與生態(tài)功能[4]，而根際微生物則通過調節(jié)有機質的分解和提高土壤肥力在植物養(yǎng)分獲取中發(fā)揮著關鍵作用[5-6]。因此，根際土壤微生物受植物種類、環(huán)境條件、土壤理化性質等多種因素的影響，不同植物種類對根際土壤微生物群落結構存在顯著影響，而同類植物在不同生態(tài)環(huán)境中的根際土壤微生物群落結構也不同[7]。對于薄殼山核桃而言，了解其根際土壤微生物群落結構特征有助于揭示根系對根際環(huán)境的影響機制，但相關研究鮮見報道。

本文以浙江省衢州市引種的薄殼山核桃為研究對象，基于Illumina MiSeq高通量測序技術，對薄殼山核桃根際與非根際土壤微生物群落結構進行研究，探討兩者之間的區(qū)別，揭示其根際效應，以期為薄殼山核桃在衢州地區(qū)的引種推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

薄殼山核桃根際與非根際土壤樣品采集于衢州市農業(yè)林業(yè)科學研究院果樹研究所試驗基地，引進的品種為波尼。選擇建園3年、栽培管理措施相同、長勢基本一致的3株薄殼山核桃，每株在樹冠滴水線處隨機選取3個取樣點取樣并混合后用于分析。采用內徑10 cm土鉆采集0～20 cm土層的樣品，收集直徑為1～5 mm的細根，用抖動法過孔徑為1 mm土壤篩獲取根際土壤樣品。同時，在同一地塊中未種植薄殼山核桃植株的空地上，采用“Z”形方法隨機采集3份非根際土壤。將土壤樣品裝入已消毒的密封塑料袋中帶回實驗室，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取和測序

采用土壤微生物DNA提取試劑盒提取薄殼山核桃根際與非根際土壤樣品基因組總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳并利用核酸定量分光光度計進行檢測，結果如表1所示。由杭州沃森生物公司通過Illumina MiSeq測序平臺進行高通量測序。細菌擴增引物為 B341F（5′-CCTACGGGNG GCWGCAG-3′）和B785R（5′-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），真菌擴增引物為 ITS-3（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）和 ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′）。

表1 土壤微生物基因組DNA檢測結果

1.3 數(shù)據處理與分析

采用DPS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據處理與分析，利用Duncan新復極差法（LSR）進行差異顯著性檢驗。在97%相似水平上對可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進行分類分析，并在不同分類水平上統(tǒng)計種類組成。采用ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)計算微生物多樣性[8-9]。使用Blast在 NCBI數(shù)據庫（https：//ftp.ncbi.nih.gov/blast/db）進行比對，將優(yōu)化序列根據數(shù)據庫中的參考序列在門、綱、目、科、屬水平上進行鑒定，比較分析其種類組成和豐度。

2 結果與分析

2.1 薄殼山核桃根際與非根際土壤微生物測序結果和數(shù)量分析

通過Illumina MiSeq高通量測序獲得了薄殼山核桃根際與非根際土壤細菌和真菌群落的優(yōu)化序列及其OTUs的信息。雙端序列（reads）拼接和過濾后，共得到薄殼山核桃根際與非根際土壤細菌序列數(shù)分別為23 786條和25 653條，非根際土壤細菌序列數(shù)比根際多1 867條；根際與非根際土壤真菌序列數(shù)分別為28 858條和40 021條，非根際土壤真菌序列數(shù)比根際多11 163條。

從表2和表3可以看出：細菌共獲得3 690個用于物種分類的OTUs，根際和非根際OTUs數(shù)量分別為 1 882個和 1 808個，兩者差異不顯著（P＞0.05）；真菌共獲得877個用于物種分類的OTUs，根際和非根際OTUs數(shù)量分別為305個和572個，兩者差異顯著（P＜0.05）。薄殼山核桃根際土壤中細菌的OTUs數(shù)量與非根際土壤相近，但真菌的OTUs數(shù)量顯著少于非根際土壤（P＜0.05），表明種植薄殼山核桃后，根際土壤中細菌的物種數(shù)量變化不大，但真菌的物種數(shù)量受到顯著影響。

表2 薄殼山核桃根際與非根際土壤細菌多樣性指數(shù)

表3 薄殼山核桃根際與非根際土壤真菌多樣性指數(shù)

2.2 薄殼山核桃根際與非根際土壤細菌多樣性

2.2.1 細菌種類組成。薄殼山核桃根際與非根際土壤中細菌相對豐度排名前3位的門分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），其中放線菌門在根際與非根際土壤中的相對豐度均達到25%以上。在綱分類水平上，薄殼山核桃根際與非根際土壤中均以放線菌綱（Actinobacteria）的相對豐度最高，根際為22.92%，非根際為28.76%。從目分類水平來看，薄殼山核桃非根際土壤中以放線菌目（Actinomycetales）相對豐度最高，根際土壤中以其他目相對豐度最高。

2.2.2 細菌多樣性。從表2可以看出，根際和非根際土壤中細菌測序覆蓋率均達97%以上，表明兩者的測序結果都可以反映其真實情況。在生物多樣性指標中，Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)的數(shù)值越大，被測樣品多樣性越高；Simpson指數(shù)值越小，生物多樣性越高。從表2可以看出，根際和非根際土壤樣品的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)值都比較大，表明兩者的細菌豐富度都比較高，但兩者之間的差異未達到顯著水平；根際與非根際土壤Simpson指數(shù)較為接近，根際土壤的Shannon指數(shù)略高于非根際，但兩者差異不顯著。由此可知，薄殼山核桃根際與非根際土壤中細菌豐富度總體較高，但兩者差異不顯著。

2.3 薄殼山核桃根際與非根際土壤真菌多樣性

2.3.1 真菌種類組成。薄殼山核桃根際與非根際土壤中真菌相對豐度均以子囊菌門（Ascomycota）最高，其中根際土壤中真菌相對豐度達82.97%，非根際土壤中真菌相對豐度達86.96%。在綱分類水平上，薄殼山核桃根際土壤中真菌以散囊菌綱（Eurotiomycetes）相對豐度最高，為 70.59%；非根際土壤中真菌以子囊菌門中未分類的綱相對豐度最高，為44.02%。從目分類水平來看，薄殼山核桃根際土壤中真菌以散囊菌目（Eurotiales）相對豐度最高，為68.95%；非根際土壤中真菌以子囊菌門中未分類的目相對豐度最高，為44.02%。

2.3.2 真菌多樣性。從表3可以看出，根際土壤和非根際土壤中真菌測序覆蓋率均達到99%以上，表明兩者的測序結果都可以反映其真實情況。從各項多樣性指數(shù)來看，Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)以及Shannon指數(shù)均為非根際土壤大于根際土壤，且差異顯著，表明非根際土壤中真菌多樣性顯著大于根際土壤（P＜0.05）；Simpson指數(shù)表現(xiàn)為非根際土壤顯著小于根際土壤（P＜0.05）。由此可見，薄殼山核桃根際與非根際土壤中真菌多樣性存在顯著差異，根際土壤真菌多樣性小于非根際土壤。

3 結論與討論

根際土壤微生物群落在植物生長、發(fā)育、營養(yǎng)和病理等方面都扮演著重要角色[10]。本研究通過Illumina MiSeq高通量測序平臺對薄殼山核桃根際與非根際土壤進行了宏基因測序，獲得細菌和真菌序列。結果發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃非根際土壤中細菌和真菌序列數(shù)分別比根際土壤多1 867條和11 163條，根際與非根際土壤中細菌的OTUs數(shù)量差異不顯著，非根際土壤中真菌的OTUs數(shù)量顯著大于根際土壤。從細菌和真菌組成來看，薄殼山核桃根際與非根際土壤中相對豐度最高的細菌為放線菌門、真菌為子囊菌門。從已有研究來看，放線菌能提高土壤抑病能力，子囊菌門的某些微生物能夠改善植物的抗菌、抗氧化作用，可以增加植物的生物量，提高植株的抗病性，促進植株生長[11]。由此可見，薄殼山核桃根際土壤中存在一些能抑制病原菌生長的微生物，可增強其對環(huán)境脅迫的耐受能力，這在其他研究中也有類似報道[12-13]。

從本研究采用的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)來看，薄殼山核桃非根際土壤中的真菌多樣性高于根際土壤，但細菌差異不顯著，這可能與薄殼山核桃根系分泌物有關。在植物生長過程中，根系分泌物影響根際微生物的種類組成，是促進植物根際形成不同微生態(tài)環(huán)境的重要因素[14]。黃玉茜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，花生（Arachis hypogaea）根系分泌物可以改變土壤中微生物群落的組成與多樣性。劉純等[16]研究發(fā)現(xiàn)，假高粱（Pseudosorghum zollingeri）根系分泌物對部分微生物有明顯的促進作用，對部分微生物有顯著的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃根系分泌物對根際土壤中不同微生物的影響效應各不相同，其對真菌具有顯著的抑制作用，但對細菌的作用并不明顯，表明其對根際土壤微生物的影響作用具有一定的選擇性。