張夢田，吳 麗，杜江燕*

（1.南京師范大學 化學與材料科學學院，江蘇 南京 210023；2.南通大學 公共衛(wèi)生學院，江蘇 南通 226000）

一氧化氮（NO）是生物體內普遍存在的一種內源性氣體分子，由線粒體一氧化氮合成酶在氧氣和還原性輔酶Ⅱ（NADPH）參與下催化內源性L-精氨酸分解生成［1］。NO在人體內作為代謝產物形成的控制生理過程的信號分子，廣泛參與多種生理和病理過程，在血小板聚集和細胞粘附、心力衰竭、血管舒張、炎癥等生命過程中發(fā)揮關鍵作用［2-3］。此外，NO 還與信號轉導、中樞神經系統(tǒng)紊亂、平滑肌松弛、分解代謝自噬過程和免疫反應［4-8］密切相關。NO 的生物學效應與其在細胞微環(huán)境中的濃度密切相關，對生物體而言，細胞內NO 是一把“雙刃劍”，較低濃度的NO 參與免疫及炎癥過程的信息傳遞，促進血管生成和腫瘤生長、轉移，而較高濃度的NO則會誘導腫瘤細胞凋亡，具有抗腫瘤作用［9］；在免疫系統(tǒng)中，較低濃度的NO 能抑制T 細胞增殖，起抗炎作用，較高濃度的NO 則會在病原體存在時引起強烈的炎癥反應［10］。大量研究表明，NO濃度失調與一些致命疾病密切相關，如青光眼、免疫紊亂、急慢性炎癥、內皮功能障礙、神經退行性疾病、動脈粥樣硬化、感染性休克和癌癥等［11-13］。因此，體內動態(tài)檢測NO對于研究其在生命活動中的生理機制，以及多種疾病及腫瘤的臨床診斷具有非常重要的意義［14］。

與化學發(fā)光法、電化學法、電子順磁共振光譜法或紫外可見吸收光譜法等分析方法相比，熒光探針技術具有靈敏度高、響應快速和抗干擾能力強等優(yōu)點，是動態(tài)檢測活細胞及活體中NO 的重要手段［15-17］。例如，Kumar課題組［18］設計并合成了一種溶酶體靶向探針LyNP-NO，可選擇性檢測活細胞中的NO，用于動態(tài)監(jiān)測大鼠腦組織中的內源性NO 水平。Xu 等［3］設計了一種智能NO 探針PYSNO，該探針對外源性和內源性NO 均表現(xiàn)出快速反應，還可用于跟蹤和研究動物組織中NO 的產生。但現(xiàn)有的檢測NO 的熒光探針仍存在靈敏度不高、選擇性差及信號易受干擾等問題。因此，亟需開發(fā)靈敏度高、專一性好的熒光探針提高NO檢測的準確度和可靠度。

2，1，3-苯并噻二唑（Benzothiadiazole，BTD）是一種缺電子雜環(huán)結構熒光受體，具有優(yōu)良的化學和光學性能，如斯托克斯位移大、吸電子能力強、光穩(wěn)定性好等特性。本文將BTD 稠合鄰苯二胺獲得的［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺（［c］［1，2，5］Benzothiadiazole-5，6-diamine，BTN）衍生物，作為NO 的特異性識別基團和電子受體，通過與NO 間的特異性反應識別NO。芴衍生物是一種重要的熒光分子，通過C9 位官能團的修飾可調控熒光性能。將芴衍生物作為給電子基團，噻吩作為π 橋與BTN 共價結合，構建了供體-受體-供體（D-A-D）型熒光探針4，7-雙（5-（9，9-二辛基-9H-芴-2-基）噻吩-2-基）苯并［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺（4，7-Bis（5-（9，9-dioctyl-9H-fluoren-2-yl）thiophen-2-yl）benzo［c］［1，2，5］thiadiazole-5，6-diamine，BTBTN）。此探針結構中鄰苯二胺與NO 反應后形成苯并三氮唑結構，分子內電荷轉移（ICT）效應增強，吸收光譜明顯紅移，熒光探針在紅光波段處熒光減弱，而在近紅外波段處熒光增強，可實現(xiàn)NO 的比率計量檢測。相較于傳統(tǒng)的增強型或猝滅型NO 熒光探針，該探針通過比率計量熒光可實現(xiàn)背景熒光低、抗干擾能力強的NO近紅外熒光分析和檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

賴氨酸、甘氨酸和抗壞血酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DL-同型半胱氨酸、L-半胱氨酸、9，9-二辛基-2-溴芴、N-乙酰-L-半胱氨酸和丙酮醛購于上海麥克林生化科技有限公司；4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑、谷胱甘肽和一氧化氮供體鹽（2-（N，N-二乙基氨基）-二氮烯-2-氧鈉鹽水合物）購于Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；其他試劑購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純。溶液用二次水配制。

核磁共振碳譜（13C-NMR）、核磁共振氫譜（1H-NMR）測試實驗采用Bruker Avance III HD 400 MHz超導核磁共振儀。高分辨率質譜儀（HRMS）采用美國Thermo Fisher Scientific 公司生產的Orbitrap Fusion Lumos。紫外吸收光譜實驗采用日本島津公司生產的UV-1900型紫外可見光譜儀。熒光光譜實驗采用英國愛丁堡公司生產的FS-5型熒光光譜儀。

1.2 熒光探針（BTBTN）的合成與表征

1.2.1 化合物BTBTN的合成路線將4，7-二溴-2，1，3-苯并噻二唑（C6H2N2SBr2）與濃硝酸、三氟甲烷磺酸（CF3SO3H）等原料在一定條件下反應生成化合物1（C6O4N4SBr2）；將2-（三丁基錫）噻吩（C16H30SnS）、化合物1、四（三苯基膦）鈀［Pd（PPh3）4］在一定條件下反應生成化合物2（C14H6O4N4S3）；將化合物2 溶解于N，N-二甲基甲酰胺（C3H7ON）和乙腈混合溶劑中，分次加入N-溴代琥珀酰亞胺（C4H4NO2Br）和微量溴化氫反應完成后，得到橘紅色化合物3（C14H4O4N4S3Br2）；將9，9-二辛基-2-溴芴（C19H41Br）、聯(lián)硼酸頻那醇酯（C12H24O4B2）、無水醋酸鉀及［1，1’-雙（二苯基膦）二茂鐵］二氯化鈀二氯甲烷絡合物［PdCl2（dppf）2CH2Cl2］等試劑反應得到化合物4（C35H53O2B）；利用Suzuki 偶聯(lián)反應將化合物4 偶聯(lián)到化合物3，再投入含有甲醇、K2CO3溶液、Pd（PPh3）4的四氫呋喃溶液中反應得到化合物5（C72H86O4N4S3）；將化合物5、鐵粉、乙酸加入密封反應容器中反應得到化合物BTBTN（C72H90N4S3），制備路線如圖1所示。

圖1 探針BTBTN的合成路線及與NO反應可能的機理Fig.1 Synthesis procedures of probe BTBTN and possible reaction mechanism with NO

1.2.2 探針BTBTN 的核磁共振光譜結果1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 7.76-7.66（m，6H），7.64（s，2H），7.52（d，J=3.7 Hz，2H），7.40（d，J=3.7 Hz，2H），7.37-7.29（m，6H），2.06-1.96（m，8H），1.35-0.93（m，44H），0.81（t，J = 7.1 Hz，12H），0.65（d，J = 7.8 Hz，8H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ 151.70（s），150.99（d，J = 14.3 Hz），147.08（s），141.16（s），140.73（s），139.39（s），134.32（s），132.99（s），129.85（s），127.33（s），126.97（s），124.94（s），123.28（s），123.01（s），120.32（d，J = 18.5 Hz），119.88（s），107.51（s），55.35（s），40.59（s），31.93（s），30.19（s），29.38（s），23.93（s），22.74（s），14.23（s），0.14（s）。

1H-NMR和13C-NMR的實驗結果表明所得產物為目標化合物BTBTN。

1.3 溶液的配制

BTBTN 儲備液的配制：準確稱量一定質量的BTBTN 樣品，溶解于四氫呋喃（THF）中，配制質量濃度為5 mg/mL的BTBTN貯備液，于4 ℃下避光保存。

HEPES 緩沖液（0.01mol/L，pH 7.4）的配制：準確稱取1.1915 g C8H18N2O4S（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）固體，向其中加0.5 L 水，超聲、攪拌至完全溶解，得到0.01 mol/L HEPES 酸液。準確稱取0.4 g NaOH溶于10 mL水中，配制1 mol/L NaOH 溶液作為堿液。將上述酸液和堿液按照一定比例混合，配制不同pH值的緩沖液。

樣品溶液的配制：在比色皿中加入0.665μL HEPES 緩沖液和1.335μL THF，再取2.3μL 探針母液，用1 mL移液槍吹打均勻，制備探針濃度為5μmol/L的樣品溶液，總體積為2 mL左右。

NO 溶液的配制：準確稱取一定量的NO 供體鹽，在一定量的水中加入適量NO，配制質量濃度為5 mg/mL的NO溶液，立即冷凍在-20 ℃冰箱中，現(xiàn)取現(xiàn)用。

1.4 紫外吸收光譜實驗

將上述探針溶液（5μmol/L）及HEPES緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）分別加入到兩個樣品池中，進行紫外吸收光譜測試。為了消除溶劑誤差，待初始工作基線穩(wěn)定后再開始樣品的測試。測試BTBTN 與NO響應實驗時，在測試液中加入適量濃度的NO儲備液（最終濃度50μmol/L）。充分反應后，記錄熒光探針紫外吸收峰強度的變化。

1.5 熒光光譜實驗

以410 nm 作為樣品的激發(fā)光波長，狹縫寬度2 nm，向石英比色皿中加入HEPES 緩沖液和樣品溶液，使得配制的熒光探針BTBTN 的最終濃度為5μmol/L。測試BTBTN 與NO 響應實驗時，在測試液中分別加入適量濃度的NO 儲備液（最終濃度為50μmol/L）。充分反應至信號不再變化時，記錄熒光探針的最大發(fā)射峰強度。

2 結果與討論

2.1 熒光探針與NO作用的光譜研究

為了考察探針BTBTN 對NO 的響應情況，測定了BTBTN 與NO 反應前后的紫外吸收光譜和熒光光譜。結果如圖2A 所示，BTBTN 的紫外光譜（曲線a）在355 nm 處有1 較強吸收峰，在410 nm 處有1 弱吸收峰。加入NO 后（曲線b）顯示355 nm 處的吸收峰消失，而410 nm 處的吸收峰明顯增強，同時在660 nm 處產生1 新吸收峰，表明BTBTN 與NO 發(fā)生了化學反應，有新物質生成，且溶液由紅色變?yōu)樗{色（如圖2A插圖）。

圖2B 為探針BTBTN 與NO 作用前后的熒光光譜，如曲線a 所示，BTBTN 在410 nm 激發(fā)光輻射下，只在640 nm 處有發(fā)射峰，且熒光強度較弱。加入NO 后，640 nm 處的發(fā)射峰明顯降低，且在775 nm 處出現(xiàn)1 明顯的發(fā)射峰，這可能是由于BTBTN 分子中鄰苯二胺的兩個氨基基團與NO 發(fā)生反應生成了新物質，ICT 效應增強使探針在775 nm 處發(fā)出近紅外熒光。圖2B 插圖表明，探針BTBTN 與NO 作用后產生明顯的顏色變化，進一步證明BTBTN 與NO 反應產生了新的熒光物質。上述實驗結果表明探針BTBTN可用于NO的檢測。

圖2 探針BTBTN與NO作用前后的紫外吸收光譜（A）及熒光光譜（B）Fig.2 UV-Vis absorption spectra（A）and fluorescence spectra（B）of probe BTBTN in the absence and presence of NO HEPES buffer-THF/H2O（2∶1），pH 7.4；concentration of BTBTN：5μmol/L；λex=410 nm

2.2 熒光探針對NO的檢測機理研究

熒光探針BTBTN 是以鄰苯二胺修飾的［c］［1，2，5］噻二唑-5，6-二胺作為NO 識別基團和電子受體，基于BTBTN 與NO 反應前后的光譜變化，推測BTBTN 上的鄰苯二胺基團與NO 發(fā)生環(huán)化反應，生成苯并三氮唑結構的產物。為了證實這一推斷，考察了BTBTN 與NO 反應前后的高分辨質譜，結果如圖3所示。在正離子模式下，BTBTN 在m/z=1107.6 處有1 強的分子離子峰。當探針BTBTN 與NO 反應后，在負離子模式下，m/z=1116.6處出現(xiàn)1新的強分子離子峰（圖3B），該數(shù)值與化合物BTBTNO的理論相對分子質量（m/z=1117.6）相對應，符合BTBTNO 的三氮唑在質譜中失去了單質子H，表明探針確實被NO還原成化合物BTBTNO，從而驗證了圖1提出的探針BTBTN與NO反應的機理推測。當探針與NO結合，二氨基苯并-（1，2，5-噻二唑）部分的弱電子受體將轉化為具有強吸電子能力的三唑并稠合苯并-（1，2，5-噻二唑），然后生成產物BTBTNO，并由增強的ICT效應開啟近紅外熒光。

圖3 BTBTN（A）及BTBTN與NO反應后（B）的質譜圖Fig.3 MS spectra of BTBTN（A）and its reactant after BTBTNO treating with NO（B）BTBTN：Calc. for C72H90N4S3：1106.6328. Found：1107.57［MA+H］+；BTBTNO：Calc. for C72H87N5S3：1117.6124. Found：1116.6［MB-H］-）

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為獲得最佳的檢測靈敏度，分別對溶劑THF配比、反應時間和溶液pH值進行優(yōu)化。如圖4A所示，隨著溶劑中THF 含量的增大，BTBTN 的熒光強度呈先升高后降低現(xiàn)象，當溶劑THF 和水的體積比為2∶1時，BTBTN對NO的響應能力最強。

為了探究反應時間對探針熒光強度的影響，考察了探針BTBTN分別與不同濃度（8、16、70μmol/L）NO混合后，其熒光強度隨時間的變化情況。結果顯示，BTBTN與NO在3 min內反應即達到平衡，表明BTBTN可快速與NO結合并產生熒光響應，因此，選擇3 min作為探針與NO的反應時間。

pH 值對熒光強度的影響如圖4B所示，在pH 6.0～8.0范圍內，探針BTBTN 對NO 具有較穩(wěn)定的熒光響應，表明BTBTN 適用于生理pH 范圍內NO 的檢測。因此，選擇pH 7.4 為HEPES 緩沖液（HEPES buffer-THF/H2O（2∶1））的最佳pH值。

圖4 溶劑配比（A）及pH值（B）對熒光強度的影響Fig.4 Effects of volume ratios of THF to water（A）and pH value（B）on fluorescence systems of BTBTN HEPES buffer：0.01 mol/L，BTBTN：5μmol/L

2.4 標準曲線、線性范圍與檢出限

為了探究熒光探針對NO 的檢測靈敏度，測試了BTBTN 與不同濃度（0～50μmol/L）NO 在HEPESTHF 緩沖液（pH 7.4）中的熒光光譜。從圖5 可知，探針的熒光強度隨著NO 濃度的增加而增加，且BTBTN 在775 nm/640 nm 的熒光強度比值F775nm/F640nm與NO 的濃度在0～10μmol/L 范圍內呈良好的線性關系，線性方程為Y=0.2792+0.3282×［NO］（r2=0.9939），式中［NO］為NO 的濃度（μmol/L），Y為F775nm/F640nm的比值。根據(jù)檢出限的計算公式（LOD=3σ/k，σ為空白樣品連續(xù)測定3次的標準偏差，k為標準曲線斜率），測得方法對NO的檢出限為28.88 nmol/L。

圖5 探針BTBTN 與不同濃度NO 作用后的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of BTBTN upon addition of different concentrations of NOBTBTN：5μmol/L，HEPES buffer-THF/H2O（2∶1），pH 7.4；inset：relationship between NO concentration and fluorescence intensity（F775 nm/F640 nm）

與文獻報道的其他NO 探針的檢測結果相比（表1），探針BTBTN 對NO 具有較低的檢出限?；诒痉椒▽O響應速度快、檢測靈敏度高的特點，可實現(xiàn)對體外NO含量的快速、靈敏的熒光定量檢測。

表1 本方法與文獻報道的檢測NO熒光探針的檢出限比較Table 1 Comparison of detection limits of the method with the other fluorescent probes for NO

2.5 選擇性實驗

為了考察探針BTBTN 對NO 檢測的選擇性和抗干擾能力，以常見的不同種類分析物作為干擾物，測試了BTBTN 的熒光光譜。檢測對象包括：6 種氨基酸（Hcy、GSH、L-Cys、L-Lys、Gly、NAC，濃度均為5.0 mmol/L）、2 種生物小分子（丙酮醛、抗壞血酸，濃度均為50μmol/L）、6 種金屬離子（Na+、Ca+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+，濃度均為1.0 mmol/L）、5 種陰離子、Br-、I-，濃度均為1.0 mmol/L）、5種活性氧及活性氮物種（·OH、1O2、ClO-、H2O2、ONOO-，濃度為100μmol/L）。當向5μmol/L BTBTN溶液中加入30μmol/L NO后，其熒光強度比值（F775nm/F640nm）迅速增大。將上述干擾物加入到熒光探針溶液中充分反應后，未觀察到F775nm/F640nm的明顯變化，表明上述測試物中，只有NO 能觸發(fā)BTBTN 探針的近紅外熒光，表明BTBTN 對NO 檢測具有較好的選擇性和抗干擾能力，可滿足生物樣品中NO的檢測要求。

3 結論

本文以鄰苯二胺修飾的苯并噻二唑衍生物作為NO 識別基團和電子受體，以芴的衍生物作為供電子熒光基團，設計并合成了一種新型近紅外比率型熒光分子探針BTBTN。該探針與NO 反應后生成苯并三氮唑結構，分子內電荷轉移（ICT）效應增強，熒光發(fā)射光譜明顯紅移，探針在紅光區(qū)的熒光發(fā)射減弱，而在近紅外區(qū)的熒光明顯增強，通過兩者間的熒光變化可實現(xiàn)NO 的比率計量檢測。探針BTBTN對NO 的熒光檢測具有響應快速（3 min）、檢出限低（28.88 nmol/L）及在生理pH 范圍內穩(wěn)定性好和選擇性高的特征，有望用于復雜細胞和活體環(huán)境中NO的定量檢測。