樊輕亞，白澤方，汪學(xué)猛，王萬(wàn)好

（1.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.河南同源制藥有限公司，河南 信陽(yáng) 464000）

藥用狗牙花是我國(guó)特有的夾竹桃科狗牙花植物，主要分布于我國(guó)南部各省，具有清熱解毒、降壓、消腫止痛之功效，臨床可用于高血壓、咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、腫瘤等疾病的治療［1］。該植物主要含有生物堿和黃酮類化合物，研究者從藥用狗牙花中提取得到了吲哚類生物堿［2-4］，其中冠狗牙花堿、伊波加明、伊波加因、伏康京堿、山辣椒堿、老刺木堿等是含量較多的成分。這些生物堿成分在戒毒、抗腫瘤、降血壓、抗病毒等方面具有較好的藥理活性［5-7］。

生物堿的分離純化方法多為液液萃取法和固相萃取法等，傳統(tǒng)的液液萃取法具有操作繁瑣、有機(jī)溶劑用量大、殘留多、成本高和污染環(huán)境等缺點(diǎn)。分散固相萃取法和固相萃取法的原理相似，均是利用目標(biāo)檢測(cè)物與雜質(zhì)的極性不同，選取與雜質(zhì)極性相近的吸附劑從提取試劑中直接去除雜質(zhì)，從而達(dá)到富集和凈化樣品的效果。但傳統(tǒng)固相萃取法的操作步驟復(fù)雜且時(shí)間長(zhǎng)，溶劑消耗量大，不利于大批量樣品的快速分析；且固相萃取小柱種類多，難以選擇一種合適的固相萃取小柱。而分散固相萃取法利用少量吸附劑加入到提取液中吸附雜質(zhì)，具有操作簡(jiǎn)單、萃取時(shí)間短、選擇性高、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，且有機(jī)溶劑消耗少、凈化過(guò)程無(wú)需額外的有機(jī)試劑，成本低，綠色環(huán)保，在食品、醫(yī)藥化工等農(nóng)藥殘留及痕量檢測(cè)領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［8-12］。目前，分散固相萃取用于中草藥有效成分分離純化方面的研究也有報(bào)道，但在藥用狗牙花萃取分離方面的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS/MS）最早于1996 年問(wèn)世，與傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）法相比，具有速度快、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用［14-17］。本文采用PSA 和NH2混合吸附劑凈化樣品，并與UPLC-MS/MS 聯(lián)用測(cè)定狗牙花中6 種生物堿的含量。該方法簡(jiǎn)單快速、凈化效果好、選擇性好，靈敏度和精密度高，可快速檢測(cè)狗牙花中6 種生物堿的含量，為狗牙花的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

美國(guó)Waters Xevo TQ-MS 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源；冠狗牙花堿、伊波加明、伊波加因、伏康京堿、山辣椒堿、老刺木堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；C18、N-丙基乙二胺（PSA）、NH2、N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物固相柱（HLB）、SCX、PCX 吸附劑（上海宸喬生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）。實(shí)驗(yàn)用狗牙花藥材均購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為藥用狗牙花（Ervatamia officinalis Tsiang）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取稱取一定量過(guò)100目篩的狗牙花樣品于50 mL離心管中，按固液比（g∶mL）1∶20加入一定量的1%氨水甲醇溶液，40 ℃水浴超聲15 min，4000 r/min 離心10 min，吸取上清液，重復(fù)2 次，合并上清液，濃縮。移取上層清液氮吹濃縮至近干，加入5 mL甲醇，渦旋1 min復(fù)溶，備用。

1.2.2 分散固相萃取凈化將上述復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，加入200 mg PSA 和200 mg NH2吸附劑，渦旋2 min，4000 r/min 離心5 min，過(guò)濾，氮吹濃縮至干，用UPLC 流動(dòng)相進(jìn)行溶解后，待測(cè)定。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取6 種對(duì)照品（冠狗牙花堿、伊波加明、伊波加因、山辣椒堿、老刺木堿、伏康京堿）各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取6種儲(chǔ)備液各1 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters 公司）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸銨（B），梯度洗脫程序：0～3 min，2%～10%A；3～10 min，10%～50%A；10～17 min，50%～85%A；17～20 min，85%～2%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子模式；離子源溫度：130 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣（N2）流速：9.0 L/min；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

中藥材中有效成分提取是基于各種成分在有機(jī)溶劑中的溶解性能差異，因此提取溶劑對(duì)各待測(cè)物的提取率有較大影響。本實(shí)驗(yàn)分別選擇水、甲醇、乙醇、乙腈、1%氨水甲醇作為提取溶劑，考察了不同溶劑對(duì)6種生物堿提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，上述5 種提取溶劑對(duì)狗牙花的提取率相差較大，在水和乙醇中的提取效果相對(duì)不佳，且水和乙醇提取的色素、脂肪等非極性干擾物較多，不利于后續(xù)凈化。甲醇和乙腈的提取率較優(yōu)，由于乙腈價(jià)格高于甲醇，選擇甲醇作為提取溶劑。進(jìn)一步在甲醇中加入一定比例的氨水，結(jié)果顯示，由于狗牙花中生物堿在植物細(xì)胞中大部分以鹽的形態(tài)存在，加入氨水使得生物堿游離為分子狀態(tài)，能有效抑制分析物發(fā)生離子化反應(yīng)，從而增加分析物在有機(jī)相中的分配比例，因此1%氨水甲醇比純甲醇的提取效率更高。且1%氨水甲醇提取后的色譜圖中雜質(zhì)較少，基線和峰形好，所以選擇1%氨水甲醇作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)6種生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the yields of six alkaloids

提取溶劑的用量對(duì)提取效率亦有較大影響，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳提取溶劑，進(jìn)一步考察了待測(cè)樣品用量與溶劑用量的固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對(duì)6 種生物堿提取率的影響。結(jié)果顯示，固液比在1∶10以下時(shí)的提取率較低，這是由于提取溶劑用量較少時(shí)，待測(cè)物濃度較大，不能很好地提取出各待測(cè)物，且會(huì)造成較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。隨著固液比的增加，待測(cè)物的提取率逐漸增加，當(dāng)固液比超過(guò)1∶20時(shí)，提取率增加不多，且溶劑過(guò)多會(huì)增加氮吹時(shí)間，因此選擇固液比為1∶20。

2.2 吸附劑的選擇

狗牙花中黃酮類、脂類、糖類等成分會(huì)干擾待測(cè)物的分析，而且會(huì)損壞檢測(cè)儀器和色譜柱。實(shí)驗(yàn)考察了C18、PSA、NH2、HLB、SCX、PCX 6 種吸附劑對(duì)6 種生物堿回收率的影響（見(jiàn)圖2）。由圖2 可知，弱陽(yáng)離子吸附劑HLB、C18的凈化回收率一般，這是由于C18吸附劑具有疏水作用，對(duì)非極性的組分有吸附；HLB 吸附劑是一類用于酸性、中性和堿性化合物的通用型吸附劑，對(duì)極性化合物具有較強(qiáng)的保留，因此對(duì)待測(cè)生物堿也有一定的吸附作用。SCX 柱和PCX 柱是利用聚合物填料合成的新型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，具有表面親水和強(qiáng)陽(yáng)離子交換特性，對(duì)生物堿的吸附較強(qiáng)，不利于凈化。PSA 和NH2的凈化效果較好，且對(duì)生物堿無(wú)吸附，這是由于PSA 吸附劑在硅膠上鍵合乙二胺-N-丙基官能團(tuán)，主要作用力是弱陰離子交換作用，可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，有效去除脂肪酸、有機(jī)酸、極性色素及糖；NH2是由硅膠鍵合氨丙基，兼具極性吸附和弱陰離子交換作用，可通過(guò)弱陰離子交換或極性吸附達(dá)到保留作用。因此，選擇PSA和NH2兩種填料作為吸附劑。

圖2 6種吸附劑對(duì)生物堿回收率的影響Fig.2 Effect of six adsorbents on the recovery of alkaloids

實(shí)驗(yàn)對(duì)NH2和PSA兩種吸附劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化。設(shè)計(jì)了5個(gè)質(zhì)量水平，5 mL提取液中分別加入吸附劑的用量為50 mg NH2+ 50 mg PSA、100 mg NH2+ 100 mg PSA、150 mg NH2+ 150 mg PSA、200 mg NH2+200 mg PSA、250 mg NH2+250 mg PSA。結(jié)果表明，當(dāng)吸附劑用量較低時(shí)，凈化不完全，目標(biāo)化合物的提取率較低。隨著吸附劑用量的增加，生物堿的提取率增加，當(dāng)吸附劑用量增至200 mg時(shí)，提取率達(dá)到最大，此后增加吸附劑的用量提取率反而降低。這是由于吸附劑用量過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附，從而降低目標(biāo)化合物的提取率。實(shí)驗(yàn)最終選擇吸附劑的用量為200 mg PSA和200 mg NH2。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件的優(yōu)化對(duì)狗牙花經(jīng)分散固相萃取后的提取液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，考察了有機(jī)相溶劑（甲醇、乙腈）中加入不同種類的緩沖液（三乙胺、乙酸銨、甲酸銨、氨水等）作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)待測(cè)物分離效果和質(zhì)譜電離的影響。結(jié)果表明，采用乙腈作為有機(jī)相的待測(cè)物峰形及響應(yīng)值均優(yōu)于甲醇。在有機(jī)相中添加甲酸銨可使質(zhì)譜電離過(guò)程的離子化程度更高，質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，且有利于改善色譜峰峰形。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇梯度洗脫方式，以乙腈-0.1%甲酸銨溶液為流動(dòng)相，6種生物堿獲得良好的分離度，峰形好、柱效高，可滿足狗牙花中生物堿的快速分析要求。狗牙花經(jīng)分散固相萃取后的總離子流色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 狗牙花經(jīng)分散固相萃取后的總離子流色譜圖Fig.3 Chromatogram of extract from Ervatamia officinalis Tsiang by dispersive solid phase extraction1. coronaridine；2. ibogamine；3. ibogaine；4. voacangine；5. tabernaemontanine；6. vobasine

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及裂解途徑采集全掃描模式下正離子、負(fù)離子信號(hào)，結(jié)果顯示負(fù)離子模式下幾乎無(wú)質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇響應(yīng)良好的ESI（+）作為離子化模式，分別找出6 種化合物的［M+H］+，作為準(zhǔn)分子離子峰。將母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)產(chǎn)生子離子，進(jìn)一步優(yōu)化干燥氣流速、碰撞電壓和錐孔電壓等參數(shù)，選擇2 個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為監(jiān)測(cè)碎片離子，選擇響應(yīng)值最大的子離子進(jìn)行定量分析，6種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 6 alkaloids

在ESI（+）-MS/MS 條件下，6 種化合物主要發(fā)生側(cè)鏈斷裂，根據(jù)質(zhì)譜二級(jí)數(shù)據(jù)可推測(cè)其裂解途徑。本文的6 種生物堿母核均有吲哚環(huán)，伊波加因和伏康京堿為10-位甲氧基取代的吲哚類生物堿，發(fā)生10-位甲氧基斷裂，其他4 種生物堿為未取代的吲哚類生物堿；伊波加明和伊波加因的16位未被取代，冠狗牙花堿、山辣椒堿、老刺木堿、伏康京堿的16 位均有—COOCH3，均發(fā)生脫—COOCH3反應(yīng)；6 種生物堿共同的質(zhì)譜斷裂特征為20位發(fā)生斷裂，老刺木堿的20位脫去乙烯基，其它5種生物堿發(fā)生20位脫乙基反應(yīng)。6種生物堿的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 6種生物堿的二級(jí)質(zhì)譜圖與質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 MS/MS spectra and fragmentation pathways of 6 alkaloids

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

分別稱取一定量的6 種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，配制成1、5、10、20、40、80、100 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按UPLC-MS/MS 條件進(jìn)行測(cè)定，以待測(cè)物的色譜峰面積（Y）和對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出線性回歸方程。分別以信噪比S/N=3 及S/N=10 計(jì)算該方法的檢出限和定量下限。由表2 可知，6 種生物堿的線性范圍均為1～100 mg/L，相關(guān)系數(shù)不低于0.9837，檢出限為0.05～0.10 mg/L，定量下限為0.15～0.35 mg/L，表明本方法的靈敏度良好。

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別準(zhǔn)確稱取3 份樣品，測(cè)得6 種生物堿的含量分別為冠狗牙花堿（690 μg/g）、伊波加明（302 μg/g）、伊波加因（268 μg/g）、伏康京堿（211 μg/g）、山辣椒堿（445 μg/g）、老刺木堿（395 μg/g）。分別添加1、10、50 mg/L 3 個(gè)質(zhì)量濃度的6 種生物堿混合對(duì)照品溶液，采用本方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，平行測(cè)定6 次，結(jié)果見(jiàn)表2。6 種生物堿的加標(biāo)回收率為93.2%～98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%～2.9%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 6種生物堿的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Linear relations，detection limits，quantitation limits，recoveries and RSDs of 6 alkaloids（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

在優(yōu)化的萃取條件下，精密稱取6 個(gè)產(chǎn)地狗牙花藥材各10 g，按照本方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，并進(jìn)行3個(gè)水平（1、10、50 mg/L）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平測(cè)定6次（見(jiàn)表3）。

表3 6個(gè)產(chǎn)地狗牙花中生物堿的分析結(jié)果（n=6）Table 3 Analytical results of 6 alkaloids in Ervatamia officinalis Tsiang from 6 place of origin（n=6）

由表3可知，6個(gè)產(chǎn)地的狗牙花中均檢出6種生物堿，含量為0.07～0.86 mg/g，其中冠狗牙花堿的含量最高，伊波加明、伊波加因、伏康京堿在各產(chǎn)地中的含量相差較大；海南產(chǎn)地的6 種生物堿含量整體高于其它產(chǎn)地，而四川產(chǎn)地的6 種生物堿含量整體低于其他產(chǎn)地，這些含量和分布的差別可能與該植物生長(zhǎng)時(shí)所需的溫度與地質(zhì)條件有關(guān)。因此在提取狗牙花中生物堿時(shí)，應(yīng)根據(jù)其組成和含量分布進(jìn)行產(chǎn)地篩選，以獲得更高的提取率，降低生產(chǎn)成本。6 個(gè)產(chǎn)地狗牙花中6 種生物堿的加標(biāo)回收率為91.5%～98.6%，RSD 為1.1%～2.9%，說(shuō)明所建立方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，適用于不同產(chǎn)地狗牙花中6種生物堿的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文將分散固相萃取技術(shù)應(yīng)用于狗牙花中生物堿的萃取，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了各因素對(duì)6 種生物堿提取率的影響，并與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用測(cè)定了狗牙花中6 種生物堿的含量。該方法前處理操作簡(jiǎn)單，凈化效果好，靈敏快速，是一種具有發(fā)展前景的萃取技術(shù)，可為后繼藥物的研究和開(kāi)發(fā)提供理論及數(shù)據(jù)支撐。