茍擁軍 ，嚴(yán) 林 ，王煊鍇 ，潘文佳 ， 鞏 添 ，3，孟永宏 ，3

（1.西安市長(zhǎng)安區(qū)氣象局，陜西 西安 710110；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；3.教育部西部果品資源高值利用工程中心，陜西 西安 710119）

蘋果因富含維生素（如核黃素、硫胺素、維B6和維C） 和多酚等多種生物活性成分，具有抗氧化、抗炎和預(yù)防血栓等多種功效[1-4]。2019年，我國(guó)蘋果種植面積達(dá)195 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量約4 242.54 萬(wàn)t，占到果品總產(chǎn)量15%[5]，位居世界首位。盡管蘋果資源豐富，但因具有時(shí)令性、關(guān)鍵加工技術(shù)的欠缺和鮮銷狀況嚴(yán)峻等問(wèn)題，造成蘋果資源嚴(yán)重浪費(fèi)，產(chǎn)品綜合利用率低，嚴(yán)重限制了蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

近年來(lái)，乳酸菌發(fā)酵蘋果汁因其豐富的生理功能和口感深受消費(fèi)者喜愛(ài)，為促進(jìn)蘋果深加工利用提供了新的途徑。乳酸菌在果蔬發(fā)酵過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在厭氧條件下能夠利用蘋果汁中的糖類產(chǎn)生乳酸，使蘋果汁pH 值迅速降低，從而抑制有害微生物生長(zhǎng)，延長(zhǎng)蘋果汁的保質(zhì)期[6]。另外，乳酸菌發(fā)酵在保留原有果蔬特有風(fēng)味的基礎(chǔ)上，還可賦予其全新的營(yíng)養(yǎng)特性，如降血壓、降血脂、降血糖等[7-8]。但目前為止用于蘋果汁發(fā)酵的商業(yè)化乳酸菌數(shù)量有限，導(dǎo)致果蔬發(fā)酵飲品的市場(chǎng)占有率低，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力低下[9]。因此，從天然發(fā)酵食品中分離、篩選和鑒定適宜蘋果汁發(fā)酵的乳酸菌菌株，建立乳酸菌菌庫(kù)，對(duì)整個(gè)果蔬發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。

試驗(yàn)選取市場(chǎng)上不同產(chǎn)地天然發(fā)酵食品，分離純化得到乳酸菌菌株并進(jìn)行蘋果汁發(fā)酵。以蘋果汁發(fā)酵液的pH 值、可滴定酸、總糖含量、活菌數(shù)及風(fēng)味分析為篩選指標(biāo)，綜合比較乳酸菌發(fā)酵性能和蘋果汁發(fā)酵液的感官評(píng)價(jià)，篩選得到最適宜發(fā)酵蘋果汁的菌株，提供優(yōu)質(zhì)乳酸菌資源，用于發(fā)酵蘋果汁的乳酸菌菌庫(kù)，促進(jìn)蘋果深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

試驗(yàn)所用樣品選自6 個(gè)不同產(chǎn)地的傳統(tǒng)發(fā)酵制品。

6種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的信息見表1。

表1 6種傳統(tǒng)發(fā)酵食品的信息

1.1.2 試劑和儀器

主要試劑：MRS 肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；引物，27F（5'-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3'），1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。

主要儀器：SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；ZC-250 型全溫振蕩培養(yǎng)箱，太原培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；GSP-9080MBE 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；2-16PK 型Sigma 臺(tái)式離心機(jī)，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；Smar Tongue 型電子舌，Isenso Group Corporation 產(chǎn)品；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海精科有限公司產(chǎn)品；UPT-II-20T 型超純水機(jī)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)，Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2 NFC 果汁制備

試驗(yàn)所用新鮮蘋果，均來(lái)自于陜西當(dāng)?shù)芈宕ǜ皇刻O果。將新鮮蘋果洗凈，去皮去核、切塊，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5‰的抗壞血酸水溶液中浸泡護(hù)色，榨汁后用2 層紗布過(guò)濾得到蘋果濁汁；用食用堿（Na2CO3）調(diào)節(jié)pH 值至6.4 左右，沸水浴煮沸5 min 后趁熱分裝在已滅菌的200 mL 玻璃瓶中并倒置玻璃瓶，冷卻后置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 乳酸菌分離

（1） 取樣和活化。分別取0.2 mL 不同來(lái)源發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵液，接種至3.8 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速170 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，觀察菌體生長(zhǎng)狀況。

（2） 平板涂布分離法[10]。選取活化2 次的發(fā)酵液，用無(wú)菌生理鹽水以10 倍梯度稀釋到10-4，10-5，10-63 個(gè)梯度后涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察生長(zhǎng)菌落形態(tài)特征。

（3） 菌種純化。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，反復(fù)純化后得到單菌落，甘油保藏后置于-80 ℃冰箱備用。

（4） 乳酸菌初篩。將單菌落的活化發(fā)酵液少量均勻涂于載玻片中心位置，酒精燈外焰固定。然后分別滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色1 min，水洗；革蘭氏碘液作用1 min，水洗；95%乙醇脫色約15～30 s，水洗，注意切勿過(guò)分脫色；滴加番紅染液復(fù)染1 min，水洗，晾干后在顯微鏡下進(jìn)行觀察菌體形態(tài)，并根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行菌株的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 發(fā)酵性能測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)曲線

參考GB 478935—2016，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 產(chǎn)酸效率

pH 值計(jì)測(cè)定發(fā)酵果汁的pH 值，測(cè)定3 次取平均值。

采用酸堿滴定法：參考GB/T 12456—2008 食品中總酸的測(cè)定[11]。取5 mL 果汁發(fā)酵液稀釋至50 mL后，以酚酞為指示劑，用濃度為0.01 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液滴定至粉紅色且30 s 不褪色，根據(jù)公式（1） 計(jì)算蘋果汁中的可滴定酸含量。

式中：X——食品中總酸含量，以乳酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，%；

C——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的準(zhǔn)確值，mol/L；

V1——滴定發(fā)酵樣液時(shí)消耗氫氧化鈉溶液的體積，mL；

V2——空白試驗(yàn)時(shí)消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；

k——乳酸的換算系數(shù)，0.090；

F——稀釋倍數(shù)；

m——試樣的質(zhì)量，g。

1.4.3 降糖速率

采用3,5 - 二硝基水楊酸比色法測(cè)定[12-13]。具體操作如下：

（1） 3,5- 二硝基水楊酸（DNS） 的配制。準(zhǔn)確稱取6.5 g DNS 加熱溶解至2 mol/L NaOH 溶液325 mL中，然后加入45 g 丙三醇搖勻，室溫冷卻后蒸餾水定容至1 000 mL 棕色容量瓶中，室溫放置1 周后備用。

（2） 配制質(zhì)量濃度為1 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣液。準(zhǔn)確稱取0.1 g 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至100 mL，充分混勻即得1 g/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣液。

（3） 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[14]。分別移取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣液，蒸餾水補(bǔ)足溶液至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80，100 mg/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取1 mL 梯度質(zhì)量濃度葡萄糖溶液于試管中，加入2 mL DNS 試劑振蕩搖勻，沸水浴顯色3 min后，于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定其吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4） 發(fā)酵液中總糖的測(cè)定。吸取0.25 mL 發(fā)酵液于50 mL 容量瓶中，加入6 mol/L 的鹽酸溶液2.5 mL，再加入蒸餾水25 mL，搖勻，置于70 ℃水浴鍋中加熱20 min，再添加5 mol/L NaOH 溶液2.5 mL，定容至50 mL，混勻備用。吸取1 mL 5 倍蒸餾水稀釋定容液于試管中，加入2 mL DNS 試劑混勻，置于沸水浴中顯色3 min 后，于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定其吸光度，總糖以葡萄糖計(jì)。

1.4.4 風(fēng)味評(píng)價(jià)

（1） 感官鑒評(píng)[15]。選取實(shí)驗(yàn)室感官評(píng)定人員20 名，以色澤（20分）、氣味（30分）、組織狀態(tài)（20分）和味道（30分） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)發(fā)酵蘋果汁進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

發(fā)酵蘋果汁的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 發(fā)酵蘋果汁的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（2） 電子舌的測(cè)定[16-17]。采用電子舌對(duì)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的發(fā)酵蘋果汁的風(fēng)味及差異性進(jìn)行分析。發(fā)酵蘋果汁以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min 后取上清液于品杯中進(jìn)行樣品測(cè)定，進(jìn)樣量15 mL，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。所有樣品采集完成后，利用電子舌軟件進(jìn)行模型分析、傳感器優(yōu)化和PCA分析。

1.5 乳酸菌鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察

挑選篩選得到的菌株在MRS 固體培養(yǎng)基于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察其菌落的特征，包括菌落的大小、顏色、透明度、凸起程度、邊緣情況等，并進(jìn)行鏡檢，觀察菌株的細(xì)胞形態(tài)。

1.5.2 生理生化鑒定

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》進(jìn)行乳酸菌生理生化特性鑒定。首先進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，然后篩選出革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性菌株進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)[18-19]。

1.5.3分子生物學(xué)鑒定

采用16S rRNA 基因序列同源性分析鑒定初篩得到的菌株[20]。

菌株 DNA 的提取[21-22]：

（1） 待測(cè)菌株接種于4 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng)24 h。

（2） 取1 mL 菌液于1.5 mL 無(wú)菌離心管，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心2 min 得到菌體。若沉淀較少，可重復(fù)操作步驟（2）。

（3） 加入 500 μL 200 mmol/L LioAc 溶液，1%SDS 溶液，振蕩混勻后70 ℃下金屬浴15 min。

（4） 加入等體積 （500 μL） 的飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1） 溶液，旋渦振蕩至乳白色，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min。

（6） 吸取上層水相 （400～450 μL） 于 1.5 mL 無(wú)菌離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻。

（7） -20 ℃冰箱放置2 h 后，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，得到DNA。

（8） 加入1 mL 70%乙醇清洗DNA（重復(fù)2 次），離心4 min，棄去上清液。

（9） 將含有DNA 的離心管倒扣在干凈的濾紙上15 min，于50 ℃下金屬浴2 min，直至乙醇揮發(fā)完全。

（10） 將 DNA溶解于 50 μLEluent 溶液中，-20 ℃下保存。

（11） 將提取DNA 送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。比對(duì)測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列比對(duì)，找出親緣性最近的乳酸菌種屬。菌株之間的相似度若達(dá)到97%，則說(shuō)明屬于同一種屬，若相似度達(dá)到99%，則能夠說(shuō)明屬于同一亞種[23]。

1.6 乳酸菌增殖培養(yǎng)

1.6.1 初始pH 值優(yōu)化

將增殖培養(yǎng)基的初始pH 值分別調(diào)整為6.1，6.4和6.7，接入2%乳酸菌活化液，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，每隔3 h 測(cè)定pH 值，直到pH 值穩(wěn)定后測(cè)其活菌數(shù)。

1.6.2 接種量?jī)?yōu)化

分別將乳酸菌活化液以2%，4%和6%的接種量在最佳初始pH 值的增殖培養(yǎng)基中接種，于37 ℃下的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 h 測(cè)定pH 值，直到pH 值穩(wěn)定后測(cè)其活菌數(shù)。

1.6.3 生長(zhǎng)因子制備

取新鮮番茄100 g，洗凈、切片后加100 mL 蒸餾水熱燙5 min，用榨汁機(jī)搗碎榨汁，雙層紗布過(guò)濾汁液，pH 值調(diào)節(jié)至6.4，巴氏殺菌15 min 后，置于4 ℃下備用。

取新鮮胡蘿卜100 g，洗凈、切片后加100 mL蒸餾水煮沸5 min，用榨汁機(jī)搗碎榨汁，雙層紗布過(guò)濾汁液，pH 值調(diào)節(jié)至6.4，巴氏殺菌15 min 后，置于4 ℃冰箱中備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株形態(tài)特征分析

從6種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中初篩得到10株符合特征的乳酸菌，其中產(chǎn)品1，2 和3 各分離得到1株，產(chǎn)品4 和產(chǎn)品5 各分離得2株，產(chǎn)品6分離得到3株，編號(hào) FBEL001～FBEL010。

6種不同產(chǎn)地天然發(fā)酵食品中分離的乳酸菌形態(tài)特征見表3。

由表3 可知，初步確定FBEL001～FBEL010 均為乳酸菌，其中桿菌7株、球菌3株，均為革蘭氏陽(yáng)性菌。

表3 6種不同產(chǎn)地天然發(fā)酵食品中分離的乳酸菌形態(tài)特征

2.2 菌株生理生化鑒定

菌株生理生化鑒定見表4。

表4 菌株生理生化鑒定

由表4 可知，分離出的10株菌生理生化鑒定結(jié)果表示，10株菌株的過(guò)氧化氫、明膠液化和硫化氫試驗(yàn)均為陰性；其中，5株菌株（FBEL001，F(xiàn)BEL004，F(xiàn)BEL005，F(xiàn)BEL007 和 FBEL010） 均發(fā)酵甘露糖、山梨醇、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和鼠李糖，但是FBEL002 不發(fā)酵山梨醇、蔗糖和鼠李糖，F(xiàn)BEL003，F(xiàn)BEL008 和FBEL009 不發(fā)酵山梨醇，F(xiàn)BEL006 不發(fā)酵麥芽糖。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸菌細(xì)菌的分類鑒定與試驗(yàn)方法》進(jìn)行對(duì)照分析，初步判定為10株均為乳酸菌，其中FBEL001～FBEL003，F(xiàn)BEL005，F(xiàn)BEL008～FBEL010 為乳桿菌，F(xiàn)BEL004和FBEL006～FBEL007 為乳酸菌球菌。另外，根據(jù)10株菌株的生理生化鑒定，F(xiàn)BEL002 可能為戊糖乳桿菌。

2.3 菌株發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

產(chǎn)酸能力、降糖能力和生長(zhǎng)速率是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)。將10株乳酸菌進(jìn)行蘋果汁發(fā)酵后，經(jīng)過(guò)感官分析初步剔除有明顯腐敗味道或基本不生長(zhǎng)的菌株FBEL003，F(xiàn)BEL005，F(xiàn)BEL006，F(xiàn)BEL008和FBEL009，再對(duì)初篩得到的5株菌株FBEL001，F(xiàn)BEL002，F(xiàn)BEL004，F(xiàn)BEL007 和 FBEL010 進(jìn)行發(fā)酵性能評(píng)價(jià)。

乳酸菌的發(fā)酵性能評(píng)價(jià)見圖1。

圖1 乳酸菌的發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

由圖1（a）可知，F(xiàn)BEL001，F(xiàn)BEL002，F(xiàn)BEL004，F(xiàn)BEL007 和FBEL010 5株菌株的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，在48 h 內(nèi)發(fā)酵蘋果汁的pH 值均能降到4.5 以下。其中，F(xiàn)BEL004 和FBEL010 的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵24 h時(shí) pH 值已降至 4.37 和 4.43。FBEL001，F(xiàn)BEL002 和FBEL007 的產(chǎn)酸能力一般，48 h 時(shí)發(fā)酵蘋果汁的pH 值才降到4.21，4.13 和4.43。所有菌株發(fā)酵72 h 時(shí)，果汁發(fā)酵液的pH 值逐漸平穩(wěn)（4.0 左右）。由圖1（b） 可知，5株菌株發(fā)酵的蘋果汁的可滴定酸含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。其中，F(xiàn)BEL004 和FBEL010 發(fā)酵蘋果汁在72 h 時(shí)的可滴定酸含量最高，分別達(dá)到10.42 g/kg 和 10.12 g/kg。FBEL001 和 FBEL007 的可滴定酸含量最低，分別為4.6 g/kg 和4.41 g/kg。結(jié)合圖1（a） 和圖1（b），可看出這5 菌株的產(chǎn)酸能力從大到小依次為 FBEL004 ＞ FBEL010 ＞ FBEL002 ＞ FBEL001 ＞FBEL007。由圖1（c） 可知，5株菌株發(fā)酵的蘋果汁的總糖含量（以葡萄糖計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.009 2X+0.073 4，R2=0.999 2） 隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵72 h 時(shí)FBEL004 的發(fā)酵蘋果汁的總糖含量最低，為69.12 g/L。FBEL007 的總糖含量最高，為94.93 g/L。由圖 1 （d） 可知，5株菌株 FBEL001，F(xiàn)BEL002，F(xiàn)BEL004，F(xiàn)BEL007 和 FBEL010 均在蘋果汁中生長(zhǎng)狀況較好。發(fā)酵初期（0～6 h） 5株菌株處于適應(yīng)果汁環(huán)境階段，生長(zhǎng)緩慢。6 h 后菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)迅速；36 h 后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。其中，F(xiàn)BEL004 和 FBEL010 在 6～24 h 增長(zhǎng)快速，24 h活菌數(shù)達(dá)到7.2×107CFU/mL；48 h 活菌數(shù)最高，達(dá)到 8.9×108CFU/mL。FBEL001，F(xiàn)BEL002 在 12～36 h快速增長(zhǎng)，36 h 活菌數(shù)分別達(dá)到1.6×108CFU/mL 和2.3×108CFU/mL。FBEL007 在 0～72 h 內(nèi)生長(zhǎng)相對(duì)平緩，48 h 活菌數(shù)最少，為1.49×108CFU/mL。綜合評(píng)價(jià)5株菌株的產(chǎn)酸能力、降糖能力和菌株生長(zhǎng)狀況，F(xiàn)BEL004 和FBEL010 的發(fā)酵性能最佳，F(xiàn)BEL001，F(xiàn)BEL002 次之，F(xiàn)BEL007 最差。

2.4 蘋果汁發(fā)酵液風(fēng)味分析

發(fā)酵蘋果汁的感官品質(zhì)評(píng)價(jià)（包括色澤、氣味、味道和組織狀態(tài)） 是生產(chǎn)中重要的一環(huán)，可用來(lái)預(yù)測(cè)消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的喜好程度。

48 h 時(shí)蘋果汁發(fā)酵液感官評(píng)價(jià)（95%置信區(qū)間）見表5。

由表5 可知，發(fā)酵48 h 后FBEL001 和FBEL002發(fā)酵的蘋果汁色澤、組織狀態(tài)、香氣、味道和總感官評(píng)分較高（分別為78.6分和81.6分），發(fā)酵蘋果汁色澤呈淺黃色，果肉均勻無(wú)沉降，乳酸風(fēng)味濃郁，無(wú)刺激氣味產(chǎn)生，整體可接受程度高。FBEL004 和FBEL010 發(fā)酵果汁顏色略深，果汁黏稠，有輕微乳酸風(fēng)味和刺激味，整體可接受度一般；FBEL007 的感官評(píng)分最低（52.7分），發(fā)酵蘋果汁色澤呈褐色，果肉大量沉降，有刺激氣味產(chǎn)生，整體可接受程度最差。另外，利用電子舌采集不同菌株發(fā)酵的蘋果汁在不同時(shí)間內(nèi)的風(fēng)味數(shù)據(jù)，采用主成分分析法（PCA）分析果汁風(fēng)味變化和菌株差異性。

表5 48 h 時(shí)蘋果汁發(fā)酵液感官評(píng)價(jià)（95%置信區(qū)間）/分

5種發(fā)酵蘋果汁的主成分分析圖見圖2。

圖2 5種發(fā)酵蘋果汁的主成分分析圖

由圖2 可知，在24 h，48 h 和72 h 時(shí)，主成分1（PC1） 和主成分2（PC2） 的累計(jì)貢獻(xiàn)率分別達(dá)到63.82%，69.94%和90.89%。因此，48 h 和72 h 時(shí)PC1 和PC2 基本可以代表發(fā)酵蘋果汁的味道特征，進(jìn)而反映菌株間的差異性。果汁發(fā)酵24 h 和48 h 時(shí)展現(xiàn)了相似的分布趨勢(shì)，F(xiàn)BEL001，F(xiàn)BEL002，F(xiàn)BEL004和FBEL010 樣本空間距離較接近，但與空白組的空間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明FBEL001，F(xiàn)BEL002，F(xiàn)BEL004 和FBEL010 逐漸開始發(fā)酵，且發(fā)酵蘋果汁的風(fēng)味相似。相反，F(xiàn)BEL007 和空白組樣本空間距離較為接近，說(shuō)明FBEL007 發(fā)酵速度較慢，風(fēng)味和原始果汁相似。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)（72 h），不同菌株發(fā)酵的蘋果汁風(fēng)味差異性較大。其中，F(xiàn)BEL004 和FBEL007 的空間距離比較接近，F(xiàn)BEL001，F(xiàn)BEL002，F(xiàn)BEL010 和空白組的空間距離比較接近，但這2 組間的空間距離較遠(yuǎn)。

2.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

綜合分析菌株發(fā)酵性能與蘋果汁發(fā)酵液的風(fēng)味，F(xiàn)BEL001，F(xiàn)BEL002 發(fā)酵的蘋果汁產(chǎn)品總體品質(zhì)較好，發(fā)酵風(fēng)味純正，兼具蘋果果香和乳酸味，消費(fèi)者接受度高。對(duì)篩選出的FBEL001 和FBEL002 提取基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物經(jīng)16S rDNA 測(cè)序，得到FBEL001 和FBEL002 的序列?；?6S rDNA基因序列，構(gòu)建菌株FBEL001 和FBEL002 與報(bào)道的用于果蔬發(fā)酵的菌株[24-27]的系統(tǒng)發(fā)育樹。

基于16S rDNA 基因序列 FBEL001 和FBEL002的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA 基因序列FBEL001 和FBEL002 的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖3 可知，菌株FBEL001 與植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum ST-III） 聚于一支，親緣關(guān)系最近；菌株FBEL002 與戊糖乳桿菌 （Lactiplantibacillus pentosus GPB20-2） 聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合FBEL001 和FBEL002 形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將菌株FBEL001 鑒定為植物乳桿菌，菌株FBEL002 鑒定為戊糖乳桿菌。

2.6 增殖培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.6.1 初始pH 值

適宜的pH 值利于乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，pH 值在影響乳酸菌原生質(zhì)膜的同時(shí)，還會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)物的生成。因此，在適宜的pH 值范圍內(nèi)，乳酸菌的代謝會(huì)加快，菌株活力高。為了確定初始pH 值對(duì)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌菌株的影響，分別測(cè)定了在初始pH 值為 6.1，6.4 和 6.7 時(shí)，F(xiàn)BEL001 和 FBEL002 的發(fā)酵性能和菌株生長(zhǎng)情況。

初始 pH 值對(duì) FBEL001 （a） 和 FBEL002 （b） 發(fā)酵性能和菌株生長(zhǎng)情況（c） 的影響見圖4。

圖4 初始pH 值對(duì)FBEL001（a） 和FBEL002（b） 發(fā)酵性能和菌株生長(zhǎng)情況（c） 的影響

由圖 4 可知，3 個(gè)初始 pH 值對(duì) FBEL001 和FBEL002 發(fā)酵性能的影響不同。當(dāng)初始pH 值為6.4時(shí)，F(xiàn)BEL001 的發(fā)酵性能最好，活菌數(shù)最高，達(dá)到1.31×109CFU/mL；當(dāng)初始pH 值為6.7 時(shí)，F(xiàn)BEL002的發(fā)酵性能最好，活菌數(shù)最高，達(dá)到1.55×109CFU/mL。因此，F(xiàn)BEL001 和FBEL002 的培養(yǎng)基pH 值分別設(shè)定為 6.4 和 6.7。

2.6.2 接種量

接種量會(huì)直接影響乳酸菌的發(fā)酵性能和增殖速率。接種量較大時(shí)乳酸菌延滯期縮短，迅速增殖，但菌株生長(zhǎng)過(guò)快導(dǎo)致發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，限制菌株生長(zhǎng)；接種量較小時(shí)，乳酸菌延滯期縮短，生長(zhǎng)緩慢，增加染菌的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了確定接種量對(duì)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌菌株的影響，確定最佳接種量，分別測(cè)定了2%，4%和6%的接種量對(duì)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的發(fā)酵性能和菌株生長(zhǎng)情況。

接種量對(duì) FBEL001（a） 和 FBEL002（b） 發(fā)酵性能和菌株生長(zhǎng)情況（c） 的影響見圖5。

圖5 接種量對(duì)FBEL001（a） 和FBEL002（b） 發(fā)酵性能和菌株生長(zhǎng)情況（c） 的影響

由圖5 可知，不同接種量對(duì)FBEL001 和FBEL002的發(fā)酵性能和生長(zhǎng)情況的影響不同。當(dāng)接種量為6%時(shí)，F(xiàn)BEL001 發(fā)酵性能最好，菌株增殖最快，最高活菌數(shù)達(dá)到1.65×109CFU/mL；而戊糖乳桿菌菌株的最適接種量為4%，最高菌數(shù)達(dá)到1.68×109CFU/mL。這種差異可能取決于本身乳酸菌接種液中活菌數(shù)的不同。但相對(duì)于2%的接種量，接種量4%和6%能顯著提高初始接種菌量，縮短菌株延滯期，提升菌株增殖活力，促進(jìn)菌株快速發(fā)酵達(dá)到最高活菌數(shù)。

2.6.3 生長(zhǎng)因子添加

發(fā)酵培養(yǎng)基是制備高活菌數(shù)乳酸菌菌劑的關(guān)鍵，取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的成分。乳酸菌對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分比較苛刻，通常研究者會(huì)添加生長(zhǎng)因子促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)代謝。綜合乳酸菌對(duì)生長(zhǎng)因子的需求量和生長(zhǎng)因子的原料成本問(wèn)題，研究了番茄汁、胡蘿卜汁作為生長(zhǎng)因子對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)代謝的影響。

生長(zhǎng)因子對(duì)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌菌株的發(fā)酵性能的影響見圖6。

圖6 生長(zhǎng)因子對(duì)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌菌株的發(fā)酵性能的影響

由圖6 可知，番茄汁和胡蘿卜汁的添加均對(duì)FBEL001 和FBEL002 的生長(zhǎng)代謝具有促進(jìn)作用，提高了FBEL001 和FBEL002 的發(fā)酵性能。與空白組相比，F(xiàn)BEL001 和 FBEL002 在前期 （0～24 h） 發(fā)酵產(chǎn)酸速度加快，24 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，最終pH 值為4.0 左右。通過(guò)對(duì)最終蘋果汁發(fā)酵液中的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)番茄汁的增菌效果更佳，尤其是FBEL002。FEBL001 和 FEBL002 最高活菌數(shù)分別達(dá) 3.2×109CFU/mL 和4.05×109CFU/mL。可能是因?yàn)榉阎形⑸锖偷V物質(zhì)離子等生長(zhǎng)因子，同時(shí)又富含大量有利于乳酸菌增殖的碳水化合物[28]。而番茄汁的添加更有利于戊糖乳桿菌增殖的原因可能是番茄汁中的碳水化合物更有利于戊糖乳桿菌度的利用。胡蘿卜汁富含胡蘿卜素、番茄紅素和小分子氨基酸，也是良好的生長(zhǎng)因子補(bǔ)充劑，但對(duì)植物乳桿菌菌株的增殖不強(qiáng)。番茄汁資源豐富、廉價(jià)易得，并且適用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，選擇番茄汁作為FBEL001和FBEL002 的生長(zhǎng)因子來(lái)源。

3 結(jié)論

選取不同產(chǎn)地的發(fā)酵食品，篩選得到10株菌株用于蘋果汁發(fā)酵。綜合分析菌株生長(zhǎng)狀況、發(fā)酵性能、總糖利用度、感官評(píng)價(jià)4 個(gè)方面結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BEL001，F(xiàn)BEL002 是最適宜用于蘋果汁發(fā)酵，發(fā)酵汁發(fā)酵風(fēng)味純正，兼具蘋果果香和乳酸味，消費(fèi)者接受度高。采用16S rDNA 鑒定FBEL001，F(xiàn)BEL002為L(zhǎng)actiplantibacillus plantarum 和Lactiplan tibacillus pentosus strain，相似度均為99%。另外，通過(guò)優(yōu)化FBEL001 和 FBEL002 增殖條件，F(xiàn)BEL001 和 FBEL002活菌數(shù)可達(dá)到3.2×109CFU/mL 和4.05×109CFU/mL。FBEL001 最佳增殖條件為初始pH 值為6.4，接種量4%，番茄汁添加量10%。FBEL002 最佳增殖條件為初始pH 值6.7，接種量4%，番茄汁添加量10%。

在發(fā)酵食品工業(yè)中，乳酸菌作為發(fā)酵菌劑已得到廣泛使用，但產(chǎn)業(yè)用菌種只有20 多種，限制了蘋果汁發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。經(jīng)過(guò)分離、篩選和鑒定后得到2株發(fā)酵性能佳的蘋果汁發(fā)酵液風(fēng)味良好的乳酸菌菌株FBEL001 和FBEL002，豐富了用于果汁發(fā)酵業(yè)的菌種庫(kù)，提高了蘋果的加工利用率，帶動(dòng)了蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。