趙歷強(qiáng)，趙德蕊，單春苗，張聲祥，施圓圓，吳家文

(1．安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230038；3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，合肥 230012)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua,PC)為百合科黃精屬植物，多生于林下、灌叢和山坡陰處[1]，是我國著名中草藥，其藥用部位為根狀莖，具有健脾、潤肺、益腎等功效[2]。多花黃精中含有多種藥用成分，主要包括多糖、黃酮、甾體皂苷等化合物[3]。多糖在多花黃精所有成分中含量較高[4]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[5-7]。

目前研究認(rèn)為多花黃精的多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等單糖構(gòu)成[8]，其生物合成途徑起始于蔗糖[9]，在果糖激酶、己糖激酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶等共同作用下合成黃精多糖[10]。果糖激酶(FRK)是黃精多糖生物合成途徑中第二個(gè)關(guān)鍵酶，催化果糖磷酸化生成6-磷酸果糖，其對果糖的親和性遠(yuǎn)大于同樣催化果糖的己糖激酶[11-12]；GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)催化1-磷酸甘露糖生成GDP-甘露糖，GDP-甘露糖在黃精中廣泛參與多糖、抗壞血酸等的生物合成[13-14]。

近年來，F(xiàn)RK在枸杞[15]、蘋果[16]、楊梅[17]等植物中被相繼發(fā)現(xiàn)和克隆，同時(shí)石斛[18]、茶樹[19]、擬南芥[20]等植物的GMPP也被成功克隆與鑒定，但多花黃精的FRK和GMPP還尚未見報(bào)道。研究通過對多花黃精的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)掘黃精多糖生物合成途徑中一系列關(guān)鍵酶基因，并利用RT-PCR技術(shù)成功克隆出關(guān)鍵酶FRK和GMPP的完整開放讀碼框，通過分析其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為揭示黃精多糖生物合成途徑中酶蛋白的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)多花黃精于2018年采自安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物園，經(jīng)中藥鑒定學(xué)專業(yè)楊青山老師確認(rèn)。將新鮮的多花黃精根、塊莖、葉用純水洗凈擦干后置于50 mL離心管中，并放入液氮中速凍2 h后置于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

實(shí)驗(yàn)器具經(jīng)高溫滅菌后，將多花黃精的各器官分別放入研缽中，加入液氮研磨至粉末，用RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對RNA進(jìn)行純化，用Agilent 2100生物分析儀檢測其濃度及完整性，高質(zhì)量的RNA作為模板進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

PCFRK和PCGMPP序列來源于多花黃精的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，使用Primer 5.0軟件在ORF兩端設(shè)計(jì)出一對特異性擴(kuò)增引物。

表1 PCFRK和PCGMPP引物序列Table 1 PCFRK and PCGMPP primer sequences

1.2.3PCFRK和PCGMPP的克隆

首先利用Oligo(dT)磁珠富集多花黃精mRNA，再以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板通過PCR對PCFRK和PCGMPP進(jìn)行擴(kuò)增。PCFRK基因較長，先用高保真酶(TOYOBO生物公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后以此PCR的產(chǎn)物為模板、用ExTaq酶(TAKARA生物公司)體系再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCGMPP基因則直接使用ExTaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的產(chǎn)物用試劑盒(AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit)進(jìn)行膠回收，從而使目的基因片段PCFRK和PCGMPP得到純化。

1.2.4 克隆載體的構(gòu)建

將pMD19-T載體與純化后的PCFRK和PCGMPP基因片段連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞(E.coliDH5α)中培養(yǎng)，挑選經(jīng)菌液PCR鑒定正確的克隆進(jìn)行測序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

利用TransDecoder(v3.0.1)軟件分析Unigene開放讀碼框(ORF)，用在線工具ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam /)計(jì)算編碼蛋白氨基酸種類、數(shù)目、相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；用MEGA 5.0和CLUSTALX 1.83軟件對篩選出的PCFRK和PCGMPP的氨基酸序列進(jìn)行比對并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用Swiss-Model(https:∥swissmodel.expasy.org/)模擬PCFRK和PCGMPP的空間結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件描繪其空間結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與PCFRK、PCGMPP基因的克隆

瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示，在28 S，18 S，5 S處分別有3條清晰明亮的條帶，說明多花黃精的總RNA提取的純度和完整性較高，可用于cDNA的合成。將富集的mRNA作為模板逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再利用PCR技術(shù)對目的基因擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示在約2 000 bp和1 000 bp處各出現(xiàn)一條亮帶，這與通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得的目的基因片段(PCFRK：Un20408，PCGMPP：Un7094)長度一致(圖1)。

(a)總RNA純化；(b)PCFRK基因的克??；(c)PCGMPP基因的克隆。(b)和(c)中箭頭示意目的基因片段。圖1 總RNA純化及PCFRK和PCGMPP基因的克隆Figure 1 Extraction of total RNA and cloning and identification of PCFRK and PCGMPP

2.2 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明PCGMPP相對分子質(zhì)量為39 650.38，理論等電點(diǎn)為6.33，為偏酸性蛋白質(zhì)，ORF為1 086 bp，編碼361個(gè)氨基酸，其中亮氨酸數(shù)量最多，為35個(gè)，占9.7%；PCFRK相對分子質(zhì)量為64 413.25，理論等電點(diǎn)為6.18，也是偏酸性蛋白質(zhì)，ORF為1 725 bp，編碼574個(gè)氨基酸，其中絲氨酸數(shù)量最多，為52個(gè)，占9.1%(圖2)。

2.3 PCFRK和PCGMPP基元和結(jié)構(gòu)域分析

利用Motif Scan軟件對PCFRK和PCGMPP蛋白的基元和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖3)，結(jié)果顯示PCFRK具有 3個(gè)糖基化位點(diǎn)，5個(gè)N-蛋白質(zhì)豆蔻酰化位點(diǎn)，16個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，19個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)；PCGMPP具有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，4個(gè)N-蛋白質(zhì)豆蔻?；稽c(diǎn)，4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(表2)。

(a)PCFRK讀碼框序列和編碼的蛋白質(zhì)序列；(b) PCGMPP讀碼框序列和編碼的蛋白質(zhì)序列。 圖2 PCFRK和PCGMPP讀碼框序列和編碼的蛋白質(zhì)序列 Figure 2 ORFs and amino acid sequences of PCFRK and PCGMPP

表2 PCFRK和PCGMPP蛋白的基元和結(jié)構(gòu)域分析Table 2 Analysis of motifs or domains of PCFRK and PCGMPP

2.4 PCFRK和PCGMPP的同源關(guān)系及進(jìn)化樹分析

將PCFRK和PCGMPP與不同植物中的FRK和GMPP進(jìn)行親緣關(guān)系比對，結(jié)果顯示在已知數(shù)據(jù)庫中PCFRK與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)親緣關(guān)系最近，PCGMPP與蘆筍(Asparagusoffcinalis)親緣關(guān)系最近(表3、表4和圖3)。

表3 PCFRK與不同物種的FRK比對Table 3 Homologous alignment of FRK proteins

表4 PCGMPP與不同物種GMPP比對Table 4 Homologous alignment of GMPP proteins

2.5 PCFRK和PCGMPP二級結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)分析

利用Pymol軟件，分別以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中的5ey7.1.B和5z0a.1.A的晶體結(jié)構(gòu)為模板模擬出PCFRK和PCGMPP的三維結(jié)構(gòu)。PCFRK二級結(jié)構(gòu)包含13個(gè)β折疊、10個(gè)α螺旋和5個(gè)TT結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)由一個(gè)大結(jié)構(gòu)域和一個(gè)小結(jié)構(gòu)域組成，大結(jié)構(gòu)域是由9個(gè)β-折疊和10個(gè)α-螺旋構(gòu)成，α-螺旋位于β-折疊的兩側(cè)，構(gòu)成“夾心餅干”狀結(jié)構(gòu)，其中“β3-α1-β4-α2-β5”構(gòu)成了Rossmann折疊，是NAD結(jié)合區(qū)域[21]；而小結(jié)構(gòu)域也被稱作蓋狀結(jié)構(gòu)域，獨(dú)立于大結(jié)構(gòu)域之外，由4個(gè)β-折疊構(gòu)成[圖4(a)]。此外，PCFRK具有磷酸果糖激酶B家族共同的保守位點(diǎn)“GG”和“DMSXSGD”[22][圖4(b)和(c)]。

(a)PCFRK進(jìn)化樹；(b) PCGMPP進(jìn)化樹。下方坐標(biāo)表示遺傳距離；黑色三角形突出顯示多花黃精中的PCFRK和PCGMPP。圖3 PCFRK和PCGMPP系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic analysis of PCFRK and PCGMPP

(a) PCFRK三級結(jié)構(gòu)模型(藍(lán)色和粉色圓圈分別表示大結(jié)構(gòu)域和小結(jié)構(gòu)域)；(b) PCFRK三級結(jié)構(gòu)模型(紅色球形和綠色球形分別表示保守位點(diǎn))；(c) PCFRK二級結(jié)構(gòu)(藍(lán)色和綠色方框分別顯示保守位點(diǎn))。圖4 PCFRK二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)模型Figure 4 The secondary structure and tertiary structure model of PCFRK

(a) PCGMPP三聚體結(jié)構(gòu)模型(紅色、藍(lán)色、綠色分別示意一個(gè)單體)；(b) PCGMPP單體結(jié)構(gòu)模型(紅色棍棒結(jié)構(gòu)示意保守位點(diǎn)，綠色球形結(jié)構(gòu)示意活性位點(diǎn))；(c) PCGMPP二級結(jié)構(gòu)(藍(lán)色方框內(nèi)顯示保守位點(diǎn)氨基酸，黑色方框內(nèi)顯示活性位點(diǎn)氨基酸)。圖5 PCGMPP二級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)模型Figure 5 The secondary structure and tertiary structure model of PCGMPP

PCGMPP空間結(jié)構(gòu)為三聚體，其單體包含22個(gè)β折疊、10個(gè)α螺旋和10個(gè)TT結(jié)構(gòu)，單體的C末端有數(shù)個(gè)規(guī)則的左手螺旋式β-折疊，構(gòu)成“杯狀”結(jié)構(gòu)，其N端具有焦磷酸化酶家族“GGXGXRLXPLX5PK”保守序列，同時(shí)也具有特異性活性位點(diǎn)“FVEKP”[23](圖5)。

2.6 PCFRK和PCGMPP基因在多花黃精不同組織中的表達(dá)

選取具有完整讀碼框且unigene的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量(FragmentsPer Kilobase per Million，F(xiàn)PKM)大于1的基因繪制熱圖，結(jié)果顯示在根狀莖中PCFRK和PCGMPP基因的總體表達(dá)量要高于葉和根，這一結(jié)果與根狀莖中多糖含量高于其他組織一致[24](圖6)。

3 討論與結(jié)論

多花黃精是我國著名的藥食同源的藥材，具有健脾、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、益腎、潤肺等功效[25-26]，其中黃精多糖是多花黃精的主要藥用成分之一，具有抗氧化、降血糖和抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[27-29]。

L：葉；R：根；T：塊狀莖；熱圖中紅色為高表達(dá)；綠色為低表達(dá)。圖6 FRK和GMPP在多花黃精不同組織中的基因表達(dá)Figure 6 Gene expression of FRK and GMPP in different tissues of PC

課題組基于高通量測序?qū)Χ嗷S精多糖生物合成途徑進(jìn)行了分析，鑒定了一系列與此途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶[24]，研究成功克隆出其中PCFRK和PCGMPP兩種關(guān)鍵酶基因。PCFRK的ORF為1 725 bp，編碼574個(gè)氨基酸，其三維結(jié)構(gòu)由一個(gè)大結(jié)構(gòu)域和一個(gè)小結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，活性中心位于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的裂隙中[30-31]。PCFRK具有兩個(gè)磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序“GG”和“DMSXSGD”[22]，其中GG為二甘氨酸構(gòu)象開關(guān)，當(dāng)腺苷與酶的特定位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，保守基序GG會(huì)發(fā)生彎曲，完成催化前構(gòu)象改變[32]；而“DMSXSGD”在構(gòu)象發(fā)生改變后形成一個(gè)陰離子通道結(jié)構(gòu)，使ATP上的磷酸轉(zhuǎn)移到腺苷上，完成6-磷酸果糖的生物合成[33-34]。目前研究表明，F(xiàn)RK是多糖生物合成中重要的關(guān)鍵酶之一，可以控制植物中果糖和蔗糖比值[35]，當(dāng)番茄中FRK過表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致生長和光合作用受損，影響多糖的合成，從而導(dǎo)致番茄果實(shí)和種子變小[36]。Yang等[37]從蘋果多糖生物合成中發(fā)現(xiàn)當(dāng)FRK代謝合成增加時(shí)會(huì)導(dǎo)致蔗糖含量下降和山梨醇的增加；趙建華等[16]對枸杞的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)果糖被FRK磷酸化后含量降低，會(huì)促進(jìn)蔗糖的分解轉(zhuǎn)化。

PCGMPP的ORF為1 086 bp，編碼361個(gè)氨基酸，空間結(jié)構(gòu)模型為三聚體，PCGMPP單體的C末端有β-折疊構(gòu)成的“杯狀”結(jié)構(gòu)，“杯體”內(nèi)部為疏水結(jié)構(gòu)，有大量脂肪族殘基[38]。PCGMPP具有焦磷酸化酶家族保守位點(diǎn)“GGXGXRLXPLX5PK”和活性位點(diǎn)“FVEKP”[23]。其中保守位點(diǎn)上的精氨酸和賴氨酸與焦磷酸鹽基團(tuán)通過靜電相互作用而結(jié)合[23]，而活性位點(diǎn)“FVEKP”與甘露糖相互作用，并在輔助因子Mg2+的共同作用下催化1-磷酸甘露糖生成GDP-甘露糖[39]，GDP甘露糖可參與細(xì)胞壁多糖合成、蛋白質(zhì)糖基化和維生素C合成等多種反應(yīng)[40-41]。Keller等[42]研究發(fā)現(xiàn)抑制土豆中GMPP的表達(dá)會(huì)引起甘露糖含量降低30%～50%；王維鵬等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥GMPP酶基因?qū)肷酥校Y(jié)果顯示其維生素C的含量明顯高于對照組；對霍山石斛GMPP研究發(fā)現(xiàn)，GMPP在不同組織中的表達(dá)水平與其組織中的多糖含量呈正相關(guān)[43]；研究表明PCFRK和PCGMPP在多花黃精塊莖中高表達(dá)與黃精多糖在塊莖中的高積累是一致的，因此推測在黃精多糖的生物合成和積累中PCFRK和PCGMPP同樣也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

研究通過對多花黃精多糖生物合成途徑兩種關(guān)鍵酶PCFRK和PCGMPP的基因克隆和結(jié)構(gòu)、性質(zhì)分析，為進(jìn)一步探究PCFRK和PCGMPP在黃精多糖生物合成中發(fā)揮的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。